陳克芳，李建軍，潘愛珍，黃啟輝，侯祥平

1 材料與方法

1.1 動物 出生1 d～3 d的SD大鼠，由中山大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM無糖培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gbico公司產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品；青霉素－鏈霉素溶液，Gibco公司產(chǎn)品；抗α－Sarcomeric actin，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；TUNEL－QIA39細胞凋亡試劑盒，購自Merck公司；SABC試劑盒及DAB顯示試劑盒，購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 藥物 山茱萸，廣東一方制藥有限公司提供。

1.4 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；熒光顯微鏡，Nikon公司。

1.5 方法

1.5.1 山茱萸總苷提取物制備 由廣東省中醫(yī)研究所按文獻［1］方法提取，提取物濃縮干燥至粉末狀。

1.5.2 心肌細胞原代培養(yǎng) 將出生1 d～3 d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心臟，迅速放入4℃預(yù)冷D－Hank’s液的培養(yǎng)皿中，洗去心臟表面及血管中的血細胞，剪去心房和大血管。將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入約10 m L0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次約10 min。收集除第1次以外的細胞懸液于50 m L離心管中，加入含量為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，終止消化。1000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕吹打使其形成單細胞懸液，將細胞懸液吸入培養(yǎng)皿中，按差速貼壁法于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，去除成纖維細胞，純化心肌細胞。之后輕輕收集尚未貼壁的細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105/m L～5×105/m L，接種于6孔培養(yǎng)板中。細胞于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每2天換一次液，培養(yǎng)3 d～4 d后使用［2］。

1.5.3 實驗分組 缺氧模型組：正常培養(yǎng)3 d的心肌細胞棄去培養(yǎng)液，換成無糖DMEM液，用無菌液狀石蠟封住液體表面，使細胞缺氧［3］。對照組：心肌細胞不做任何處理，正常條件培養(yǎng)。山茱萸總苷干預(yù)組：細胞缺氧處理之前24 h在培養(yǎng)液中加入0.49 g/L的山茱萸總苷，缺氧培養(yǎng)的同時亦加入0.49 g/L的山茱萸總苷進行干預(yù)。各組設(shè)1 h、2 h、3 h、5 h 4個時間點進行指標觀察。

1.5.4 心肌細胞的鑒定 按照SABC抗α－橫紋肌肌動蛋白試劑盒說明方法：將培養(yǎng)3 d的細胞爬片，用4%多聚甲醛固定30 min。然后用30%H2O21份＋純甲醇50份混合液室溫浸泡30 min后蒸餾水洗1次～2次，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加1∶100稀釋的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），對照組用蒸餾水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。二甲苯透明，中性樹膠封片［4］。

1.5.5 TUNEL檢測心肌細胞的凋亡率 將培養(yǎng)的細胞爬片，4%多聚甲醛固定，室溫孵育10 min后，將玻片浸沒在1×TBS溶液中，室溫孵育15 min。每個樣本玻片上滴加50μL～100 μL濃度為20μg/mL的蛋白酶K溶液，室溫孵育5 min。用1×TBS溶清洗樣本2次～3次。滴加100μL×Td T平衡緩沖液，室溫孵育20 min后，在每個樣本上立即滴加60μL Td T標記反應(yīng)混合物，置于濕盒中于37℃孵育90 min。將樣本玻片置于1×TBS溶液中室溫孵育1 min。去掉多余液體，換用新鮮1×TBS溶液室溫孵育1 min，重復(fù)1次。用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的TBS溶液，逐滴滴加Mounting Media封片劑并蓋上 蓋玻片。使用熒光顯微鏡分別用330 nm～380 nm及465 nm～495 nm波長下激發(fā)熒光，計數(shù)所有細胞和凋亡細胞，計算出凋亡率［5］。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析，圖片制作采用SPSS13.0及EXCEL進行，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組計量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA），檢驗水平取α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細胞培養(yǎng) 在倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)24 h后，細胞已基本貼壁，并伸出偽足，形態(tài)呈梭形、菱形或不規(guī)則多邊形。培養(yǎng)72 h后，心肌細胞融合成片，形成單細胞層，細胞搏動呈現(xiàn)同步化，每分鐘120次左右。

2.2 心肌細胞鑒定 心肌細胞中含有α－Sarcomeric actin，本實驗選用的一抗為小鼠抗大鼠α－橫紋肌肌動蛋白，因此染色后心肌細胞胞漿將被著深棕色，而非心肌細胞則呈陰性染色。心肌細胞的純度鑒定采用每張玻片隨機取10個視野，分別計算出心肌細胞陽性率，重復(fù)3次并取平均值為97.26%、96.875%、96.97%，三者取平均值為97.035%，因此本實驗心肌細胞的純度為97.035%。

2.3 TUNEL檢測心肌細胞的凋亡率（見表1） 正常對照組心肌細胞凋亡率極低。而在心肌細胞缺氧2 h后凋亡率明顯增高 ，3 h～5 h后達到高峰，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。用山茱萸總苷干預(yù)治療后，治療組與缺氧組相比凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 各組心肌細胞的凋亡率比較（ ±s） %

表1 各組心肌細胞的凋亡率比較（ ±s） %

組別 凋亡率對照組 0.55±0.05缺氧組 1 h 16.22±1.001）2 h 60.81±3.311）3 h 96.12±1.331）5 h 98.77±0.431）治療組 1 h 4.06±0.252）2 h 10.14±0.622）3 h 15.27±1.182）5 h 27.53±1.282）與對照組比較，1）P＜0.01；與缺氧組相比，2）P＜0.01

2.4 山茱萸總苷干預(yù)急性缺血乳鼠心肌細胞TUNEL染色結(jié)果 對照組正常心肌細胞陽性著色的細胞核很少；隨著缺氧時間延長，陽性著色比例較對照組組明顯增多；治療組較缺氧組陽性著色比例明顯減少。

3 討 論

長期以來，細胞壞死一直被認為是缺血性心肌死亡的唯一方式［6］。但是最近研究結(jié)果顯示，急性心肌梗死時早期心肌細胞死亡的主要方式為細胞凋亡，而不是心肌細胞的壞死，并且心肌梗死晚期也存在心肌細胞的凋亡［7，8］。心肌細胞凋亡與壞死是完全不同的，有研究［9］證實細胞凋亡于心肌缺血2 h后發(fā)生，4 h～5 h時最明顯，6 h后開始減少，這點在本研究中也得到了驗證。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細胞在正常情況下幾乎沒有心肌細胞的凋亡，但在缺氧時可以引起心肌細胞的凋亡，并且隨著缺氧時間的延長，凋亡細胞不斷增加，缺氧5 h時達到最高，凋亡率幾乎達到98%。因此，防治心肌細胞凋亡是治療急性心肌梗死新的治療靶點。

現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸總苷有抗炎和殺菌作用［10］，抗氧化損傷作用［11］，對急性缺血缺氧的心肌具有保護作用［12］。急性心肌缺血時線粒體的能量耗竭及活性氧的釋放是導(dǎo)致心肌細胞凋亡和壞死的主要病理改變，已有研究證實，中藥山茱萸對于實驗性心肌梗死大鼠模型的心肌細胞具有保護作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予山茱萸總苷干預(yù)后，缺氧乳鼠心肌細胞凋亡率明顯下降，而且各個時間點的凋亡率均降低?？梢娚杰镙强傑湛梢砸种菩募〖毎牡蛲觯Ｗo缺氧心肌細胞。但山茱萸總苷通過什么作用途徑抑制心肌細胞凋亡，尚需深入研究。

［1］吳紅，梁恒，劉永紅，等.山茱萸總皂苷的提取分離與含量測定［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2003，24（5）：430.

［2］辛毅，許秀芳，黃益民.乳小鼠心肌成纖維細胞和心肌細胞的分離培養(yǎng)及熒光鑒定［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2011，28（5）：541－547.

［3］曾文靜，劉菊英，柯昌斌.液體石蠟封閉法建立大鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型［J］.鄖陽醫(yī)學院學報，2010，29（2）：108－110.

［4］張乃菊，陳天平，祝曉光.乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞的原代培養(yǎng)［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2010，35（6）：558－561.

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［6］Gill C，Mestril R，Samali A.Losing heart：The role of apoptosis in heart disease a novel therapeutic target［J］.FASEB J，2002，16：135－146.

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