金學平 吳旭乾 阮建兵 周佳麟 梅春秋 牛克勤

武漢軟件工程職業(yè)學院環(huán)境與生化工程系，湖北武漢 430205

2007年葛蘭素史克（GSK）公司在美國和歐盟成功上市截短側(cè)耳素類人用抗生素瑞他莫林（retapamulin，1），使得截短側(cè)耳素（pleuromutilin，2）的市場需求不斷增加（圖1~2）。目前市場上銷售截短側(cè)耳素的規(guī)格有85%、92%、95%三種純度。銷售市場占8%的截短側(cè)耳素直接作為添加劑使用，89%用于衍生物的制造，3%用作其他。中國市場調(diào)查研究中心數(shù)據(jù)顯示，國內(nèi)截短側(cè)耳素的銷售收入2006年37 932萬元；2007年42 678萬元；2008年46 701萬元；2009年達到53 367萬元，同比增長14.27%。隨著截短側(cè)耳素衍生物開發(fā)研究的不斷深入，帶來了截短側(cè)耳素強勁的市場需求，使得截短側(cè)耳素的制備方法研究備受關(guān)注。

圖1 retapamulin，1

圖2 pleuromutilin，2

1 截短側(cè)耳素的生物合成

截短側(cè)耳素屬雙萜類化合物，而萜類化合物的生物合成通常是從乙酰輔酶A開始途經(jīng)羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）和二羥甲基戊酸（MVA）進入異戊二烯（IPP）前體合成；IPP與DMAPP（dimethylallyl pyrophosphate）形成單萜的前體物質(zhì)GPP（geranyl diphosphate），再經(jīng)縮合和異構(gòu)形成倍半萜和二萜前體物質(zhì)FPP（farnesyl diphosphate）和GGPP（geranylgeranyl diphosphate）。GGPP是截短側(cè)耳素生物合成的前體，GGPP在二萜環(huán)化酶的作用下形成三環(huán)結(jié)構(gòu)的中間產(chǎn)物，這一步是該途徑的限速步驟，二萜環(huán)化酶是一種限速酶，不同二萜環(huán)化酶所存在的差異使得該萜類化合物的化學結(jié)構(gòu)有所不同；三環(huán)結(jié)構(gòu)的中間體經(jīng)細胞色素P450氧化酶引入C3羰基、C11羥基，然后再經(jīng)?；D(zhuǎn)移酶接上C14的酰化基團，最終得到截短側(cè)耳素（圖 3）。

圖3 截短側(cè)耳素的生物合成過程

2 截短側(cè)耳素的發(fā)酵過程

截短側(cè)耳素主要采用靜置發(fā)酵或者深層液體發(fā)酵方法制備。截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌有側(cè)耳屬（Pleurotus sp.）和斜蓋菇屬（Clitopilus sp.）中的部分菌種，常用菌株為P.mutilus和P.passeckerianus。靜置發(fā)酵時采用的玉米漿培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周后，收取表層菌絲體，用葡萄球菌進行活性測定，發(fā)現(xiàn)P.mutilus菌液達到512稀釋單位/mL，P.passeckerianus為256稀釋單位/mL。深層液體發(fā)酵時，P.mutilus培養(yǎng)10 d，活性就可達到256稀釋單位，而P.passeckerianus活性較低，只有8稀釋單位。深層液體發(fā)酵時，葡萄糖的消耗約在72 h達到低點，氮源的消耗情況和碳源消耗類似。產(chǎn)物的產(chǎn)量從發(fā)酵開始逐天增加，在144 h開始逐漸達到穩(wěn)定，產(chǎn)物最大量約為2.2 mg/mL。

為了提高截短側(cè)耳素的產(chǎn)量，主要圍繞菌種改良、發(fā)酵優(yōu)化、誘導因子和分離純化幾方面展開研究工作。從分子水平上對菌體進行改良的研究時有報道，但未取得實質(zhì)性進展，截短側(cè)耳素二萜環(huán)化酶基因克隆及功能研究是重要的技術(shù)瓶頸。李冰[1]報道稱國外有科學家對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus passeckerianus的遺傳表達系統(tǒng)進行了初步的研究。誘變育種是常用的菌種選育方法，Papa等[2]用0.15 mg/mL亞硝基胍（NTG）對截短側(cè)耳素產(chǎn)菌Clitopilus passeckerianus進行誘變所得最高產(chǎn)量與親代相比提高了89.36%。陳曉麗等[3]對截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌Clitopilus prunulus-04用NTG進行誘變，篩選得到的突變子pn163的截短側(cè)耳素產(chǎn)量最高，比出發(fā)菌株提高了38.5%，且遺傳穩(wěn)定性好。黃宇琪等[4]在實驗室分離并初步鑒定P4-04為產(chǎn)截短側(cè)耳素的斜蓋菇屬的新種，在以果糖為碳源、以黃豆粉餅為氮源、添加硫酸鐵等條件下產(chǎn)量比原始條件下提高73.1%。

微生物發(fā)酵優(yōu)化常用的策略是傳質(zhì)優(yōu)化和補料優(yōu)化。產(chǎn)生菌擔子菌形狀為菌絲狀，高速攪拌和高通氣量可能會對菌絲損傷較大，而過小則可能導致供養(yǎng)不足，影響發(fā)酵過程，應(yīng)該從攪拌漿的類型和轉(zhuǎn)速、通氧量等優(yōu)化傳質(zhì)條件。補料優(yōu)化策略有：直接反饋控制補料速率法是基于pH或者溶解氧（DO）的變化超過預定值以后，系統(tǒng)自動或者人工調(diào)節(jié)補料速率，改善發(fā)酵過程；預定速率補料法是假設(shè)菌體在一定的時間范圍內(nèi)指數(shù)增加，從而補給指數(shù)增加培養(yǎng)基，以滿足生長的需要；底物反饋補料法如通過在線或者離線的方法定期檢測發(fā)酵罐內(nèi)殘?zhí)菨舛?，當其不足的時候給予補充，使其濃度在一定的范圍內(nèi)；帶放料的補料方法，陳劍慧等[5]采用在210～230、240～260、270～290 h等不同發(fā)酵時間階段實施放料10%，補料玉米漿和豆餅粉，流加葡萄糖的方法控制發(fā)酵過程，可使效價達到10 000～ 11 000 μ/mL；發(fā)酵指數(shù)為 0.036十億 /（m3·h），發(fā)酵罐利用率可達到95%～105%。

促進生物合成的誘導因子主要有添加前體、光照等。適量的抗真菌藥在適當時間添加可有效促進抗生素的生物合成，陳曉麗等[3]用制霉菌素、特比萘酚、十二烷基苯磺酸鈉和十二烷基三甲基氯化銨進行抗性突變子篩選獲得了大量產(chǎn)量提高的突變子。制霉菌素和特比萘酚抗性突變子的正突變率較高，如12 μg/mL的鹽酸特比萘酚在48 h可以有效調(diào)控截短側(cè)耳素生物合成，經(jīng)7 L發(fā)酵罐放大驗證表明較為穩(wěn)定。

3 截短側(cè)耳素的分離純化

截短側(cè)耳素的分離純化方法主要有溶劑提取法、超臨界法、膜過濾法。目前截短側(cè)耳素分離純化多采用溶劑提取法，胡昌華等[6]從截短側(cè)耳素的全發(fā)酵液中分離出菌絲體，經(jīng)干燥、粉碎、過篩，烘焙至含水量低于5%，烘焙菌絲體用醋酸丁酯浸提，過濾水洗濾液，干燥脫色，回收溶劑，靜置析晶得截短側(cè)耳素；胡江林等[7]將截短側(cè)耳素的干菌絲用甲基異丁基甲酮浸取得粗品，再用甲醇溶解后先后用石油醚和乙酸丁酯萃取，經(jīng)濃縮、結(jié)晶，乙醚洗滌、脫色得成品；Rees MJ[8]報道了甲基異丁基甲酮一步法對截短側(cè)耳素的提取純化方法，但該法溶劑使用量大，生產(chǎn)成本高；張翔等[9]分別用冰醋酸、丙酮、正己烷、無水乙醇、甲醇、水、甲基異丁基甲酮、醋酸丁酯、醋酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷作為萃取溶劑，對截短側(cè)耳素的全發(fā)酵液的干菌絲進行浸提對照試驗，同時采用單因素實驗法從提取時間、液料比、轉(zhuǎn)速、提取次數(shù)等幾方面考察其對提取率的影響，在此基礎(chǔ)上重點對醋酸丁酯浸提法進行正交實驗優(yōu)化提取條件，使截短側(cè)耳素醋酸丁酯浸提法的提取率達到94.56%。

謝昌賢等[10]將烘焙菌絲體置于超臨界萃取罐中，在壓力12～24 MPa，溫度35～55℃，二氧化碳流速為25 kg/h條件下，萃取60～100 min，然后收集萃取物，經(jīng)處理后得截短側(cè)耳素。該工藝提取時間短，產(chǎn)物雜質(zhì)少，溶劑使用量小。

王素霞等[11]將截短側(cè)耳素菌絲體與甲醇或乙醇混合，在20～40℃下持續(xù)攪拌3～6 h，將浸提液在一定壓力下通過密封式無機膜過濾，濾液送入后續(xù)加工，部分殘液返回浸提罐，另一部分經(jīng)循環(huán)泵通過無機膜循環(huán)過濾，該工藝過程比傳統(tǒng)板框過濾工藝每天縮短6～10 h，收率提高5%～7%，減少了溶劑的揮發(fā)，改善了生產(chǎn)環(huán)境。

日本住友制藥公司開發(fā)的水溶性好，代謝穩(wěn)定的截短側(cè)耳素類新衍生物，N abriva和GSK制藥公司的口服妙林類抗生素相繼進入臨床，國內(nèi)上海藥物所楊玉社等、南通大學王新楊等在新型截短側(cè)耳素衍生物的開發(fā)取得了階段性成果，預示著這類化合物良好的開發(fā)前景，直接刺激截短側(cè)耳素原料藥的產(chǎn)量需求。目前國內(nèi)外對截短側(cè)耳素原料藥的制備方法報道較少，國內(nèi)傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝存在能耗大、成本高、污染環(huán)境等問題，優(yōu)化截短側(cè)耳素的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本是攻關(guān)的重點，在產(chǎn)生菌的選育、發(fā)酵過程控制和分離純化方法等環(huán)節(jié)需要進行深入研究，尤其是在分子水平上菌種選育工作更需加強，以提高截短側(cè)耳素原料藥的質(zhì)量和產(chǎn)量，滿足當前和未來市場之需求。

[1] 李冰.截短側(cè)耳素生物合成的代謝調(diào)控與發(fā)酵優(yōu)化[D].重慶：西南大學，2011：6.

[2] Papa IA.Increasing pleuromutilin activity of clitopilus passeckerianus by chemical mutagenesisand improvement of production medium[J].Philos Agr Sci，2006（89）：20-33.

[3] 陳曉麗，張文琦，胡昌華.高產(chǎn)截短側(cè)耳素擔子菌的抗性突變株篩選[J].中國生物工程雜志，2010，30（8）：67-71.

[4] 黃宇琪，張怡，胡昌華.截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基的初篩[J].四川大學學報（自然科學版），2008，45（3）：699-702.

[5] 陳劍慧，韓勤更，冒永松，等.截短側(cè)耳素的發(fā)酵方法[P].CN101319234A，2008-12-10.

[6] 胡昌華，張翔，鄒祥.截短側(cè)耳素的溶劑提取工藝[P].CN101838199A，2010-09-22.

[7] 胡江林，王斌，王永恒，等.一種截短側(cè)耳素的提取純化方法[P].CN102050737A，2011-05-11.

[8] Rees M J.Method for reproducing pleuromutilins[P].US20060166341A1，2006-07-27.

[9] 張翔，黃宇琪，鄒祥，等.截短側(cè)耳素溶劑提取工藝的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（5）：151-155.

[10] 謝昌賢，鄧維康，劉運添，等.截短側(cè)耳素的超臨界二氧化碳萃取工藝[P].CN101885681A，2010-11-17.

[11] 王素霞，金作宏，高文杲，等.一種截短側(cè)耳素提取工藝[P].CN101481308A，2009-07-15.