孟麗娟 許家仁 王峻

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年上升。研究發(fā)現(xiàn)CKS1B基因位于染色體1q21，是SCFSkp2泛素化復合體的必要組成部分，能降解許多細胞周期調(diào)控因子，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。同時，原癌基因c-myc是一重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和凋亡，可能在MM的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。本研究對MM細胞株XG1及XG7中c-myc介導CKS1B的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進行研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株與細胞培養(yǎng)MM細胞株XG1、XG7(由蘇州大學張學光教授建立和贈送)用含IL-6 10 ng/ml、10%胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)的RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，48～72 h傳代1次，培養(yǎng)中的細胞均保持在(0.1～0.5)×106/ml的密度，實驗用細胞為對數(shù)生長期細胞。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒DNA：以人的基因組DNA和RNA為模板，用KodPlus PCR擴增CKS1B啟動子區(qū)1000 bp和c-myc mRNA全長，再經(jīng)Taq 3'末端加A后插入pGEMT-easy載體。經(jīng)測序確認正確后酶切分別插入熒光素酶報告基因pLG4.70和PCMV6-XL5載體。

最終形成如下質(zhì)粒：c-myc表達質(zhì)粒：PCMV6-XL5wtmyc，插入含3.8 kb的c-myc cDNA;對照質(zhì)粒PCMV6-XL5，不含插入片段;CKS1B啟動子報告基因質(zhì)粒pGL4.70(1000)，含1000 bp CKS1B啟動子序列，連接螢火蟲熒光素酶報告基因。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：24孔板內(nèi)接種0.5×105/孔MM細胞XG1及XG7，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜后進行轉(zhuǎn)染。按5～10 ng/孔pGL4.75，加入50 μl/孔無血清RPMI 1640，分裝并加入150 ng/孔CKS1B啟動子報告質(zhì)粒pGL4.70(1000)、600 ng/孔c-myc表達質(zhì)粒PCMV6-XL5wtmyc質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒PCMV6-XL5，混勻后加入2 μl/孔Superfect(Qiagene)，再混勻，靜置10 min。取含10%胎牛血清RPMI 1640 300 μl/孔加入質(zhì)粒、Superfect混合物，立即加入去除培養(yǎng)基的24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24～48 h。每組3～4復孔，重復3次。

1.2.3 熒光素酶報告試驗：去上清，加125 μl/孔被動裂解液(PLB)，室溫輕搖15 min，取裂解物10 000 g離心1 min，取上清按說明書用Dual-lucifrase試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性，以未作轉(zhuǎn)染的孔作本底加以扣除，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)對照計算螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值。

1.2.4 Western免疫印跡：采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建cmyc-shRNA質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染XG1、XG7，同時建立XG1-Scramble(XG1-SCR)及XG7-Scramble(XG7-SCR)細胞株作陰性對照。取2×106細胞加蛋白裂解液，離心提取蛋白，通過10%SDS-PAGE膠分離蛋白，100 V，1 h，然后轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗(抗c-myc、CKS1B及β-actin抗體)，室溫1 h，洗膜，加二抗，室溫0.5 h，成像。

1.2.5 統(tǒng)計學處理：采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，熒光素酶活性值以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，多組均數(shù)比較采用ANOVA檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光素酶報告試驗結(jié)果分別構(gòu)建c-myc編碼區(qū)序列以及CKS1B上游啟動子區(qū)1000 bp的熒光素酶報告載體。分成3組，分別為對照組，僅轉(zhuǎn)染PGL4.75質(zhì)粒;CKS1Bpro組，共轉(zhuǎn)染PGL4.75質(zhì)粒+CKS1B啟動子報告基因質(zhì)粒pGL4.70(1000)以及PCMV6-XL5空載體;CKS1Bpro+c-myc組，共轉(zhuǎn)染PGL4.75質(zhì)粒+CKS1B啟動子報告基因質(zhì)粒pGL4.70(1000)以及PCMV6-XL5-myc表達質(zhì)粒。對照組螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值為0.046±0.052，XG1-CKS1Bpro組為0.159±0.067，XG1-CKS1Bpro+c-myc組為0.656±0.086，3組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。XG7-CKS1Bpro組螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值為0.162±0.081，XG7-CKS1Bpro+c-myc組為0.663±0.077，3組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。說明c-myc可以轉(zhuǎn)錄激活CKS1B啟動子活性。

2.2 Western免疫印跡結(jié)果采用RNA干擾技術(shù)抑制XG1及XG7細胞c-myc基因表達后，Western免疫印跡顯示CKS1B蛋白表達下調(diào)。見圖1。

圖1 shRNA干擾沉默Myc基因后對CKS1B基因蛋白水平的影響

3 討論

MM分子細胞遺傳學的異質(zhì)性與臨床預后有密切的關(guān)系。近年研究顯示1q21擴增(amp1q21)是MM最常見的染色體異常之一，與MM疾病進展、復發(fā)密切相關(guān)，是MM預后差的重要指標之一［1-2］。CKS1B基因是此區(qū)域的重要基因，CKS1B基因在MM細胞的過度增殖與存活中起重要作用，其過表達與臨床早期死亡高度相關(guān)。

人類CKS1B基因編碼79個氨基酸蛋白，是SCFSkp2泛素化復合體的必要組成部分，SCFSkp2泛素化復合體能特異性識別磷酸化的底物并介導其泛素化降解，許多細胞周期調(diào)控因子都是泛素蛋白酶體途徑的底物。其中細胞周期負性調(diào)節(jié)蛋白p27 kip1是SCFSkp2泛素化和隨后蛋白降解的主要靶分子之一，CKS1B促進了Skp2與磷酸化的p27kip1的結(jié)合，導致p27kip1泛素化和隨后經(jīng)蛋白酶體降解中起重要作用［3-5］。p27kip1與Cdk2/cyclin A以及Cdk2/cyclinE復合體結(jié)合并抑制二者的功能，從而抑制細胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換，因此，其降解異?？蓪е录毎芷谖蓙y、細胞惡性增殖。在乳腺、胃腸道、肺和卵巢腫瘤和MM中均有報道CKS1B高表達均是通過促進p27kip1降解而導致腫瘤形成和進展，且此類患者預后較差［6-11］。

原癌基因c-myc是一重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)約15%的人類靶基因，從而調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和凋亡，在多種腫瘤形成過程中處于重要地位。Old等［12］研究顯示在B細胞中c-myc轉(zhuǎn)基因鼠高表達c-myc，并主要是通過誘導CKS1而抑制p27 kip1表達。CKS1基因敲除后延遲了c-myc誘導的淋巴瘤形成。我們通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合網(wǎng)站分析確定CKS1B啟動子區(qū)(起始密碼子前805～795個堿基)是myc結(jié)合位點，通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)體外發(fā)現(xiàn)c-myc基因可轉(zhuǎn)錄激活CKS1B表達，并在蛋白水平證實c-myc敲除后，CKS1B蛋白表達降低，證實在XG1細胞株中c-myc可調(diào)控CKS1B蛋白的表達。本研究發(fā)現(xiàn)通過介導CKS1B基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，c-myc在MM的發(fā)病與預后中可能具有重要作用。

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