李 勁，劉 瑩，鄧志芳，胡文娟，高 奎，趙瑞杰，王 紅，宋發(fā)軍，*

(1中南民族大學生命科學學院，武漢430074;2中南民族大學校醫(yī)院，武漢430074)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起并以肝臟炎性病變?yōu)橹骱投嗥鞴贀p害的一種危害嚴重的傳染性疾病.由于對HBV基因分型較蛋白質水平上的血清分型更準確，不同基因型的HBV感染患者在臨床病程和治療反應存在一定差異［1］，故分型有利于深入細致地研究HBV感染的流行病學、病因學和臨床診治.為分析乙肝病毒的基因分型和自然變異狀況，本研究采用改良的快速限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術對中南民族大學2008級93例15個民族乙肝大三陽患者HBV基因分型，為HBV的預防和治療提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

所有血清標本來自中南民族大學2008級93例乙肝大三陽患者，HBsAg表面抗原陽性.其中男性56例，女性37例.

1.2 方法

1.2.1 引物設計和限制酶篩選

根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.nvbi.nlm.nih.gov/)查取HBV的S區(qū)核苷酸序列，并參考文獻［2］，設計引物及篩選限制性內切酶，分別見表1和表2.PCR擴增時先采用外引物擴增得HBV的DNA長片段(1017 bp)，再用內引物擴增得目的片段(585 bp).

表1 引物設計Tab.1 Design of Primer sequence

表2 乙肝分型限制酶的選擇Tab.2 Restriction enzymes for indentification of HBV genotypes

1.2.2 HBV 的 DNA 提取

取50μL乙肝大三陽患者血清于1.5mL Ep管中，沸水浴10min后，冷卻至室溫，14000r/min離心5min，上清為模板用于PCR擴增.

1.2.3 半巢式PCR擴增

參照說明書配置PCR體系，總體積25μL，含無菌水17.5 μL，10 × buffer 2.5 μL，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，1 mmol/L dNTP 1.5 μL，0.25 U/μL Tag聚合酶1.5μL，乙肝病毒DNA模板1μL.

經(jīng)梯度PCR后確定最優(yōu)半巢式PCR程序:94℃5min;94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 45s，30 個循環(huán);72℃ 5min;4℃ 2h.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，凝膠成像儀拍照.

1.2.4 限制性內切酶酶切

按照限制酶產品說明書體系和要求進行酶切.酶切順序為BsrI→StyI→DpnI→HpaII.

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳法對基因分型的檢測

聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，以1×TBE為電解液，電壓15V/cm.電泳完成后EB染色，凝膠成像儀拍照，記錄基因分型情況.

1.2.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS17.0軟件對HBV各基因型所占比例進行χ2檢驗.

2 結果與分析

2.1 半巢式PCR產物凝膠電泳

煮沸法提取HBV DNA基因組產量較少，無法用瓊脂糖凝膠電泳檢測，故直接進行PCR.基因組S區(qū)擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1.由圖1可見，半巢式PCR產物均為585bp，DNA帶型整齊亮度清晰，除100bp以下引物二聚體外，無明顯非特異雜帶，表示PCR擴增效果好，產物特異。

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR production

2.2 HBV 基因分型

PCR產物酶切后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，HBV基因分型結果見圖2.由圖2可見，PCR產物經(jīng)BsrI酶切為126和459bp，可判斷為B1型;經(jīng)BsrI酶切為126，184和275bp，而無法被HpaII酶切的可判斷為B2型;無法被BsrI酶切，而被StyI酶切為253和332bp的可判斷為 C1型;被BsrI酶切為 285，300bp，而無法被DpnI酶切的可判斷為D3型.另外，經(jīng)BsrI、StyI、DpnI、HpaII酶切，條帶均為 585bp 無法進行分型(暫定為C2或D2型)，共8例.未發(fā)現(xiàn)除B、C、D外的HBV其他基因型.

圖 2 Bsr I、Sty I、Dpn I、Hpa II酶切 HBV 分型圖Fig.2 Diagram of HBV Genotype by Bsr I、Sty I、Dpn I、Hpa II

2.3 93例15個民族乙肝大學生HBV基因型分布

不同民族乙肝大三陽學生的HBV基因型分布見表4.由表4可見，93例大學生中B型占61.3%(57/93)，C 型占 25.8%(24/93)，D 型占 4.3%(4/93).經(jīng)χ2檢驗，B型所占比例在漢族和少數(shù)民族中均最多，C型次之，D型最少(B型和C型相比，χ2=8.7016，P=0.0032;B 型和 D 型相比，χ2=34.5516，P＜0.0001;C 型和 D 型相比，χ2=11.1263，P=0.0009).漢族的乙肝大學生中主要以B型為主(31例);少數(shù)民族中B型也較多共26例，其中壯族6例，瑤族3例，土家族3例，畬族5例，苗族2例，回族、仡佬族、毛南族、滿族、侗族、布依族、白族各1例.C型在漢族和少數(shù)民族中均較少，其中漢族13例，壯族7例，土家族、回族、黎族、蒙古族各1例;D型最少，漢族2例，壯族和黎族各1例.此外，漢族和少數(shù)民族的HBV基因B、C、D型無顯著性差異(χ2=0.029，P=0.986)，說明不同民族不影響 HBV基因型的分布.

表4 93例15個民族HBV基因型分布Tab.4 Distribution of HBV genotypes of 93 samples from 15 nationalities

3 討論

我國HBV主要以B型和C型為主，有一定的地域差異，北方以C型為主，南方以B型為主［3］.本研究中漢族、瑤族、土家族、畬族、苗族均以B型為主;仡佬族、毛南族、滿族、侗族、布依族、白族樣本少，但全部為B型;壯族、回族、黎族、蒙古族中B型和C型幾乎均等，這符合我國北方城市以C型流行為主，由北至南，B型感染率逐漸增高的規(guī)律［4］.此外，壯族和黎族患者中各檢測到一份D型，符合我國少數(shù)民族地區(qū)D型少見，而西北少數(shù)民族D型較其他少數(shù)民族多見的規(guī)律［5］.在93例乙肝大三陽患者中，男性56例，女性37例，男性感染率高于女性，與國內報道一致［6，7］，可能與男性生活衛(wèi)生和自我保護意識較女性差有關.本實驗中，漢族和壯族樣本量基本能說明我國HBV分布規(guī)律，而其他少數(shù)民族患者樣本偏少，仍需要增大樣本量深入研究.

中國是乙肝的高發(fā)區(qū)，乙肝具有傳播途徑復雜，流行面廣，感染率高的特點，嚴重危害人民的健康［8］.調查不同基因型的HBV在不同民族中的分布，可反映其在地域和人群流動性上的差異.HBV基因型與臨床治療效果和疾病發(fā)展密切相關［9］，治療前明確患者基因型，有助于個體化制定抗病毒治療方案，使療效最優(yōu);而不同基因型在病原學、流行病學、人類學、臨床治療等方面的資料，為干擾素和其他藥物治療慢性乙型肝炎提供了研究線索.

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