李洪鵬，巴方，白丹，高杰

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，沈陽(yáng) 110001；2.附屬盛京醫(yī)院康復(fù)科，沈陽(yáng) 110006）

高壓氧預(yù)處理對(duì)脊髓損傷后后角神經(jīng)元的保護(hù)作用

李洪鵬1，巴方2，白丹1，高杰1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，沈陽(yáng) 110001；2.附屬盛京醫(yī)院康復(fù)科，沈陽(yáng) 110006）

目的探討高壓氧預(yù)處理是否可以通過(guò)抑制早期的細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)脊髓后角神經(jīng)元。方法 隨機(jī)將24只雄性Wistar大鼠分成對(duì)照組與高壓氧預(yù)處理組。高壓氧預(yù)處理組在給予高壓氧5d后與對(duì)照組同時(shí)制作脊髓（T8～T10）全橫斷模型。術(shù)后8h、1d和3d取脊髓做冠狀冰凍切片，行Nissl及TUNEL染色，光鏡下觀察。結(jié)果 Nissl染色顯示，術(shù)后8h及1d時(shí)脊髓后角內(nèi)濃染的細(xì)胞多見，高壓氧預(yù)處理組與對(duì)照組比較濃染的細(xì)胞較少，3d后兩組無(wú)明顯差異；TUNEL染色顯示，術(shù)后8h及1d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞多見，8h時(shí)兩組差異明顯（P<0.05），1d時(shí)差異最顯著（P<0.01）。結(jié)論高壓氧預(yù)處理對(duì)脊髓損傷后后角神經(jīng)元起保護(hù)作用，術(shù)后1d內(nèi)保護(hù)效果明顯。

高壓氧預(yù)處理；脊髓損傷；前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；凋亡

脊髓損傷后對(duì)缺血耐受性較差，缺血缺氧可導(dǎo)致脊髓的二次損傷［1］。Chu等［2］報(bào)道缺血缺氧可誘發(fā)多種因子引起DNA損傷和修復(fù)。高壓氧可提高血液中血紅蛋白的氧飽和度，適度的高壓氧可以預(yù)防二次損傷［3］。特別是高壓氧預(yù)處理可以提高中樞神經(jīng)對(duì)缺血缺氧的耐受性，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元的生存率［4］。然而，既往的研究多停留在脊髓缺血后高壓氧預(yù)處理的保護(hù)作用，而高壓氧預(yù)處理對(duì)提高直接的脊髓損傷后神經(jīng)元的生存率鮮有報(bào)道。本研究探討了高壓氧預(yù)處理對(duì)脊髓損傷后后角神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取雄性10周齡SPF級(jí)成年Wistar大鼠，體質(zhì)量230～280g，平均250g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。24只大鼠隨機(jī)分成高壓氧預(yù)處理組和對(duì)照組，每組12只。

1.2 方法

1.2.1 高壓氧預(yù)處理：將高壓氧預(yù)處理組動(dòng)物置入NGT50B型鋼制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高壓艙（NGT50B型，煙臺(tái)宏遠(yuǎn)高壓氧艙制造有限公司）內(nèi)，以含98%O2、2%CO2的混合氣體連續(xù)洗艙10min，使艙內(nèi)氧濃度達(dá)90%以上。再以34.5kPa/min的加壓速率，在20min內(nèi)勻速加壓至0.15MPa，穩(wěn)壓60min，中間用加壓用混合氣體通風(fēng)2次，每次5min，艙內(nèi)氧濃度為98%～100%，相對(duì)濕度為60%～80%，溫度37℃。高壓氧預(yù)處理后20min內(nèi)勻速減壓出艙。治療每天1次，連續(xù)治療5d，最后一次處理后24h內(nèi)與對(duì)照組動(dòng)物同時(shí)造模。

1.2.2 脊髓損傷模型制備：兩組大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射，麻醉后俯臥位固定，在約T8～T10水平做后正中切口，逐層切開組織，暴露T9～T10棘突，咬除棘突和椎板暴露脊髓，在T9～T10之間用鋒利手術(shù)刀片行脊髓全橫切，以鼠產(chǎn)生翹尾反應(yīng)為成功標(biāo)準(zhǔn)。生理鹽水沖洗后曬少許青霉素粉，逐層縫合。術(shù)后大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，分籠清潔飼養(yǎng)。

1.2.3 動(dòng)物標(biāo)本制備：大鼠分別在術(shù)后8h、1d和3d用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉后行灌流固定，生理鹽水快速灌流后再快速灌流4%多聚甲醛（300mL）。切取以橫斷處為中心上方1.0cm長(zhǎng)的脊髓組織，浸于4%多聚甲醛后固定24h，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液24h，OCT包埋后以脊髓橫斷端為起始做10μm厚的連續(xù)冠狀冰凍切片，切片以備染色使用。

1.2.4 Nissl染色：切片經(jīng)0.02mol/L PBS沖洗3次后，在0.1%甲酚紫染色液中染色15min，再經(jīng)乙醇梯度快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固觀察。

1.2.5 TUNEL染色：試劑盒購(gòu)自凱基生物，步驟簡(jiǎn)述如下：（1）預(yù)處理：冰凍切片經(jīng)固定液、封閉液（3%H2O2溶于甲醇）以及浸入通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉）等前處理。（2）標(biāo)記反應(yīng)：切片經(jīng) TdT 酶反應(yīng)液（45μL Equilibration Buffer+1μL Biotin-11-dUTP+4μL TdT Enzyme）、Streptavidin-HRP 工 作 液 （0.5μL Strepavidin-HRP+99.5μL PBS） 及 DAB 工作液 （5μL 20×DAB+1μL 30%H2O2+94μL PBS），室溫顯色反應(yīng) 10min。切片同樣經(jīng)乙醇梯度快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固觀察。光學(xué)顯微鏡下觀察并用圖像分析儀（Meta Morph/OP10/BX41，OLYMPUS，日本）拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Nissl染色結(jié)果

脊髓后角細(xì)胞染色中多數(shù)細(xì)胞核仁清晰可見。術(shù)后8h時(shí)高壓氧預(yù)處理組（圖1A）與對(duì)照組（圖1B）相比濃染的細(xì)胞（箭頭所示）較少；1d后濃染的細(xì)胞較8h增加明顯，而對(duì)照組（圖1D）與高壓氧預(yù)處理組（圖1C）相比濃染細(xì)胞增加更明顯，且有類似腫脹細(xì)胞出現(xiàn)（箭頭所示）；3d后兩組濃染的細(xì)胞（圖 1E，F(xiàn)）均減少。

2.2 TUNEL染色結(jié)果

術(shù)后8h～1d，兩組的脊髓前角內(nèi)均可見大量的細(xì)胞核陽(yáng)性反應(yīng)。術(shù)后8h時(shí)高壓氧預(yù)處理組（圖2A）與對(duì)照組（圖2B）相比陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞（箭頭所示）略少；1d后兩組陽(yáng)性細(xì)胞增加明顯，高壓氧預(yù)處理組（圖2C）與對(duì)照組（圖2D）比較陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞（箭頭所示）明顯減少；3d后兩組均見極少量陽(yáng)性細(xì)胞（圖 2E，F(xiàn)）。

2.3 各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)

對(duì)兩組3個(gè)時(shí)間段的后角內(nèi)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，每個(gè)標(biāo)本取4張切片的同等大小的視野觀察陽(yáng)性細(xì)胞取平均值。8h、1d和3d時(shí)對(duì)照組的后角TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞的平均值分別為24.5±4.5、62.5±6.5和4.5±1.5，高壓氧預(yù)處理組分別為18.5±5.5、42.5±5.5和 4.0±0.5。脊髓損傷后 8h，對(duì)照組與高壓氧預(yù)處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；脊髓損傷后1d，對(duì)照組與高壓氧預(yù)處理組相比差異顯著（P<0.01）；脊髓損傷后3d，對(duì)照組與高壓氧預(yù)處理組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

本研究證明了高壓氧預(yù)處理可以在脊髓損傷后的短期內(nèi)提高脊髓后角細(xì)胞的生存率，說(shuō)明高壓氧預(yù)處理可以對(duì)后角神經(jīng)元起到保護(hù)作用。既往研究提示，脊髓損傷后給予高壓氧治療可以提高神經(jīng)元的生存率，并解釋為高壓氧治療的效果可能與減弱誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶基因表達(dá)有關(guān)［5］。Sakurai等［6］報(bào)道運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在脊髓缺血后8h運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元顯示膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子陽(yáng)性，海馬則在腦缺血后3h即顯示膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子陽(yáng)性［7］，而膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡的重要因子之一。高壓氧預(yù)處理常常被應(yīng)用于脊髓缺血的動(dòng)物模型，在兔的脊髓缺血模型中，脊髓缺血15min后脊髓內(nèi)的凋亡細(xì)胞產(chǎn)生于術(shù)后1d［8］。有學(xué)者認(rèn)為脊髓缺血后細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在24h內(nèi)，其發(fā)生機(jī)制與線粒體對(duì)缺血再灌注的調(diào)節(jié)相關(guān)［9］。在缺血再灌注過(guò)程中，活性氧自由基的大量產(chǎn)生可導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸移位酶的氧化巰基釋放而導(dǎo)致其通透性增加［10］，從而導(dǎo)致細(xì)胞的崩解和凋亡。早期的研究顯示高壓氧預(yù)處理可上調(diào)超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶的活性［11］，由此可以認(rèn)為本研究中對(duì)后角神經(jīng)元的保護(hù)作用可能同樣是由上述原因造成的。由于脊髓全橫斷后同樣會(huì)切斷供應(yīng)脊髓的血管，因此損傷區(qū)域產(chǎn)生與脊髓缺血同樣的結(jié)果是可以理解的。高壓氧預(yù)處理可以減輕脊髓損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫反應(yīng)是產(chǎn)生脊髓損傷后二次損傷的主要因素。因此，我們認(rèn)為高壓氧預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，并且保護(hù)作用主要體現(xiàn)在脊髓損傷后的3d以內(nèi)。

高壓氧預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制還不甚明了。但在脊髓缺血模型中，高壓氧預(yù)處理可能通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體等的崩解，進(jìn)而提高神經(jīng)元的生存率［4］。在本研究的脊髓損傷模型中我們發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理同樣在類似的時(shí)間段內(nèi)起到相同的神經(jīng)元保護(hù)作用。因此我們推測(cè)，高壓氧預(yù)處理保護(hù)脊髓損傷后的神經(jīng)元的機(jī)理同樣與提高超氧化物歧化酶有關(guān)，關(guān)于血中及組織的超氧化物歧化酶值的變化有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Tator CH，F(xiàn)ehlings MG.Review of the secondary injury theory of acute spinal cord trauma with emphasis on vascular mechanisms［J］.J Neurosurg，1991，75（1）：15-26.

［2］Chu D，Qiu J，Grafe M，et al.Delayed cell death signaling in traumatized central nervous system：hypoxia［J］.Neurochem Res，2002，27（1-2）：97-106.

［3］Dong HL，Xiong LZ，Zhu ZH，et al.Preconditioning with hyperbaric oxygen and hyperoxia induces tolerance against spinal cord ischemia in rabbits［J］.Anesthesiology，2002，96（4）：907-912.

［4］Wang L，Li W，Kang Z，et al.Hyperbaric oxygen rreconditioning attenuates early apoptosis after spinal cord ischemia in rats［J］.J Neurotrauma，2009，26（1）：55-66.

［5］Satake K，Matsuyama Y，Kamiya M，et al.Nitric oxide via macrophage iNOS induces apoptosis following traumatic spinal cord injury［J］.Brain Res Mol Brain Res，2000，85（1-2）：114-122.

［6］Sakurai M，Hayashi T，Abe K，et al.Induction of glial cell line-derived neurotrophic factor and c-ret portooncogene-like immunoreactivity in rabbit spinal cord after transient ischemia［J］.Neurosci Lett，1999，276（2）：123-126.

［7］Miyazaki H，Nagashima K，Okuma Y et al.Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor induced by transient forebrain ischemia in rats［J］.Brain Res，2001，922（2）：165-172.

［8］Jacobs TP，Shohami E，Baze W，et al.Deteriorating stroke model：histopathology，edema，and eicosanoid changes following spinal cord ischemia in rabbits［J］.Stroke，1987，18（4）：741-750.

［9］Hayashi T，Sakurai M，Abe K，et al.Apoptosis of motor neurons with induction of caspases in the spinal cord after ischemia ［J］.Stroke，1998，29（5）：1007-1013.

［10］Solenski NJ，Dipierro CG，Trimmer PA，et al.Ultrastructural changes of neuronal mitochondria after transient and permanent cerebral ischemia［J］.Stroke，2002，33（3）：816-824.

［11］Nie H，Xiong LZ，Lao N，et al.Hyperbaric oxygen preconditioning induces tolerance against spinal cord ischemia by up-regulation of antioxidant enzyme in rabbits［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（5）：666-674.

（編輯陳 姜，英文編輯劉寶林）

Spinal Cord Posterior Horn Neurons are Protected by Hyperbaric Oxygen Preconditioning after Spinal Cord Injury

LI Hong-peng1，BA Fang2，BAI Dan1，GAO Jie1
（1.Department of Human Anatomy，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Rehabilitation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110006，China）

ObjectiveTo test the hypothesis that spinal cord posterior horn neurons are protected by hyperbaric oxygen preconditioning（HBO-PC）and mediated by inhibition of early apoptosis.Methods24Wistar male rats were randomly divided into 2groups：control group and HBO-PC group.The rats in HBO-PC group were administrated HBO for 5d，their spinal cords （T8-T10）were all transected as same as the control group.At 8h，1d and 3d after operation，the spinal cords were cut for coronal frozen sections，and the sections were stained with Nissl and TUNEL staining，they were observed by light microscope and analyzed by statistics.ResultsNissl staining demonstrated that the hyperchromic cells were found in posterior horn neurons in two groups at 8h and 1d after operation，the hyperchromic cells were lesser in HBO-PC group than that of control group，no big difference between two groups at 3d postoperative；TUNEL staining demonstrated that the positive cells were most found in posterior horn neurons at 8h and 1d after the operation，there were difference between two groups at 3d postoperative.Statistic analysis demonstrated that the difference was obvious at 8h（P<0.05）and significant at 1d（P<0.01）postoperative，respectively.ConclusionTheResultsdemonstrated that HBO-PC could protect posterior horn neurons after spinal cord injury，the effects were shown most significant within 1d after spinal cord injury.

hyperbaric oxygen preconditioning；spinal cord injury；posterior horn neuron；apoptosis

R322.8

A

0258-4646（2012）01-0011-04

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1027.024

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1027.024.html

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872669）

李洪鵬（1966-），男，副教授，博士.E-mail：lihongpeng1966@hotmail.com

2011-10-25

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2012-01-1310：27