王俊風(fēng)，施美蓮，2，吳艷秋，郭建光，2，符 杰，2，孫宗國，高靜華，2，徐 平，2

（1.上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，上海 201615；2.中國科學(xué)院上海實驗動物中心，上海 201615）

昆明小鼠具有抗病力強、繁殖率和成活率高等特點，作為實驗動物在我國生物醫(yī)學(xué)動物實驗中占有一定的用量［1］，特別廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定［2］。19世紀末期，國際上逐步興起無菌動物和SPF級動物的研究，并相繼培育出了各種無菌級實驗動物，目前國內(nèi)未見關(guān)于GF級KM小鼠生長發(fā)育、生理生化指標的相關(guān)報道，GF級KM小鼠也沒有作為實驗動物模型在科學(xué)研究中進行規(guī)?；膽?yīng)用。本實驗采用剖宮產(chǎn)術(shù)，用GF級C3H/OrlSlac小鼠做代乳母鼠（2009年從法國引進），成功地培育出了GF級KM小鼠，并在無菌隔離器內(nèi)繁育擴大后，對其后代進行生長發(fā)育、臟器重量和血液生理生化指標的測定，為GF級KM小鼠的推廣和使用提供生物學(xué)特性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物來源

SPF級KM小鼠、GF級 C3H/OrlSlac小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供（SCXK【滬】2007-0005）（SYXK【滬】2007-0005）。

1.2 飼養(yǎng)管理及環(huán)境

實驗小鼠均飼養(yǎng)在隔離器中，隔離器內(nèi)的空氣為100級全新風(fēng)，室內(nèi)溫度控制在22±2℃，相對濕度45％～65％，換氣次數(shù)每小時15次；光照明暗交替12 h/d；動物自由采食和飲水。

小鼠用飼料和墊料由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供（滬飼審【2008】04002），經(jīng)60Co輻照，劑量為 50 kGy。飼料的營養(yǎng)成分為：粗蛋白21.5％ ～22.5％、粗脂肪 5.0％ ～5.5％、粗灰粉6.0％～6.5％、粗纖維4.0％～4.5％、水份≤10％、鈣1.2％ ～1.5％、磷 0.75％ ～1.0％、賴氨酸≥1.32％、蛋氨酸 +胱氨酸≥0.78％。飲用水為純水機制備的無菌酸化水，PH值3.5～4.5，并經(jīng)60Co輻照（輻照劑量為50 kGy）。使用的籠具、水瓶、鑷子等物品均經(jīng)過121℃、50 min高壓蒸汽滅菌。

1.3 實驗儀器

電子天平（精確到0.001 g，上海天平儀器廠）； 7020全自動生化儀（日本日立公司）；KX-21N全自動血球分析儀（日本 Sysmex）；5415R離心機（EPPendoff）；動物固定臺；手術(shù)剪、眼科鑷子等常規(guī)手術(shù)器械。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物凈化方法：實驗用GF級KM小鼠的獲得，是采用對SPF級KM小鼠進行剖宮產(chǎn)術(shù)，用無菌奶媽（無菌級 C3H/OrlSlac小鼠2009年自法國引進）代乳方法，2010年1月成功培育出第一批GF級KM小鼠，GF級KM小鼠在無菌隔離器內(nèi)進行繁殖傳代并擴群。

1.4.2 無菌檢測：根據(jù)國家標準《實驗動物無菌動物的生活環(huán)境及糞便標本的檢測方法》GB/T 14926.41-2001，取GF級 KM小鼠的飲水、飼料、墊料和新鮮糞便等混合物，接種到腦心浸液肉湯、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基和大豆蛋白胨肉湯，分別于37℃、37℃和27℃下進行培養(yǎng)，每天觀察并記錄（至14 d）。

1.4.3 生長曲線的測定：用天平分別稱取60只（雌雄各半）0～112 d的GF級KM小鼠體重。0～21 d每周稱兩次，21～112 d每周稱一次，用SPSS軟件繪制出GF級KM小鼠的生長曲線。

1.4.4 體重和臟器重量的測定：用電子天平分別稱取3個日齡無菌KM小鼠的體重。眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、腎上腺、卵巢、睪丸等臟器，用電子天平稱取臟器重量。1.4.5 血液生理指標測定：將小鼠眼眶采血，取20μL全血于500μL稀釋液中混勻，用Sysmex KX-21N全自動血球分析儀檢測15項血常規(guī)指標，分別為：白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細胞壓積（HCT）、紅細胞平均容量（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白容量（MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數(shù)（PLT）、紅細胞分布寬度（PDW）、血小板分布寬度（MPV）、平均血小板體積（P-LCR）、紅細胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）、紅細胞分布寬度標準差（RDW-SD）、淋巴細胞百分比（LYM％）、淋巴細胞絕對值（LYM#）。1.4.6 血液生化指標測定：將剩余的全血于4℃冰箱放置1 h后以3000 r/min離心15 min，分離出血清，用日立7020全自動生化儀檢測指標共19項，分別為：總膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、尿素氨（BUN）、球蛋白（CRE）、CA、磷（P）、IgG、IgA、IgM、C3、C4。

1.5 結(jié)果處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行一維方差統(tǒng)計分析，以平均數(shù)±標準差（±s）表示，顯著水平為P＜0.05和P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 GF級KM小鼠的微生物檢測結(jié)果

GF級KM小鼠本實驗期間共檢測6次，檢測結(jié)果見表1。

2.2 GF級KM小鼠的生長曲線

圖1為GF級KM小鼠的生長曲線。雌、雄GF級KM小鼠的體重隨年齡的增加而增加，且在斷奶（21日齡）后的1～2周內(nèi)生長最為迅速，之后體重增長變緩，最后趨于穩(wěn)定；斷奶前雌雄小鼠體重基本無差異，斷奶后雄性小鼠增重明顯快于雌性小鼠，此結(jié)果與王俊風(fēng)、施美蓮等［3］報道的關(guān)于無菌級C3H/OrlSlac小鼠的生長曲線的結(jié)果類似。GF級KM小鼠的哺乳期的體重高于左謙益，寧磊［4］報道的KM小鼠同期的生長發(fā)育數(shù)據(jù)。

2.3 GF級KM小鼠3個不同日齡的臟器參數(shù)

對同一日齡的雌、雄GF級KM小鼠臟器參數(shù)進行了統(tǒng)計分析（表2），統(tǒng)計結(jié)果顯示：（1）28日齡的雌、雄GF級KM小鼠在體重、肺、肝、右腎4項指標的均值比較上差異顯著（P＜0.05）；（2）56日齡的雌、雄GF級KM小鼠在體重、脾、腦、左腎、右腎5項指標的均值比較上存在差異；（3）112日齡的雌、雄GF級KM小鼠在體重、耳長、心、肺、腦、腎上腺、胸腺、左腎、右腎9項指標上存在差異。說明性別對GF級KM小鼠臟器參數(shù)有影響，且隨著年齡的增加存在差異的指標逐漸增加。

表1 GF級KM小鼠無菌檢測結(jié)果Tab.1 The results the examination of GF KM m ice

圖1 GF級KM小鼠的生長曲線Fig.1 The growth curves of the GF KM mice

表2結(jié)果顯示，隨著年齡的增加心、腦、肝、脾、肺等主要臟器重量逐漸增加，只有胸腺隨著年齡的增加逐漸萎縮；在解剖時還發(fā)現(xiàn)GF級KM小鼠的盲腸體積特別大（見彩插2圖2），與王俊風(fēng)，施美蓮等［3］、程水生等［5］報道的無菌小鼠的特征之一是盲腸巨大結(jié)果一致。

2.4 GF級KM小鼠血液生理指標測定結(jié)果

對同一日齡的雌、雄GF級KM小鼠血常規(guī)進行了統(tǒng)計分析（表3），統(tǒng)計結(jié)果顯示：（1）28日齡的雌、雄GF級KM小鼠在WBC、RBC、HGB、RDW-CV、HCT 5項指標的均值比較上存在差異；（2）56日齡的雌、雄GF級KM小鼠在PLT、LYM％、MCHC 3項指標的均值比較上存在差異；（3）112日齡的雌、雄GF級KM小鼠在WBC、PLT、LYM％、MCHC 4項指標上存在差異。說明性別對GF級KM小鼠血常規(guī)有影響。

從表3還發(fā)現(xiàn)隨著日齡的增加雌雄GF級KM小鼠HGB（血紅蛋白）逐漸增加、RDW±SD（紅細胞分布寬度）逐漸減小，血液中紅細胞分布寬度小說明血液中紅細胞的形態(tài)、大小一致、整齊。

2.5 GF級KM小鼠血液生化指標測定結(jié)果

對同一日齡的雌、雄GF級KM小鼠血液生化進行了統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示：（1）28日齡的雌、雄GF級KM小鼠在TCHO、HDL-C、LDL-C、GLU 4項指標的均值比較上差異極顯著（P＜0.01）；（2）56日齡的雌、雄 GF級 KM小鼠在 TP、ALB、ALT、AST、ALP、BUN 6項指標的均值比較上差異極顯著（P＜0.01）；（3）112日齡的雌、雄 GF級KM小鼠在 TCHO、TG、HDL-C、LDL-C、TP、ALB、BUN、C3 8項指標上差異極顯著（P＜0.01）；在ALP、CRE、IgG、IgA、IgM 5項指標上差異顯著（P＜0.05）。說明性別對 GF級 KM小鼠血液生化的影響比較大，且隨著年齡的增加雌雄間差異更加明顯。

表2 GF級KM小鼠不同日齡的臟器參數(shù)測定Tab.2 Determination of the organ growth of GF KM mice at different agesBALB/cJmice

表3 GF級KM小鼠不同日齡血液生理指標測定值Tab.3 Blood Physiological parameters of the GF KM mice at different ages

表4 GF級KM小鼠不同日齡血液生化指標測定值Tab.4 Blood biochemical parameters of the GF KM mice at different ages

隨著日齡的增加，所測的19項血液生化指標中反映腎功能的BUN（尿素氨）和ALB（白蛋白）先增加又減小；血糖（GLU、CA）、P、免疫球蛋白和補體逐漸減小與王俊風(fēng)，施美蓮［3］報道的無菌級 C3H/ OrlSlac小鼠的結(jié)果一致，這一結(jié)果與無菌動物生活在無菌環(huán)境下，機體的免疫系統(tǒng)處于休眠狀態(tài)，沒有接受任何菌群的刺激有關(guān)；CRE（球蛋白）先減小后又增加。

3 討論

在無菌動物的培育和飼養(yǎng)過程中，無菌狀態(tài)的維持是一個難點，從隔離器的消毒、無菌動物的傳入到平時的物品傳入和傳出都必須進行嚴格的無菌操作，另外定期進行無菌檢測也是維持無菌狀態(tài)的關(guān)鍵；經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)所有GF級KM小鼠盲腸無一例外地明顯膨大，幾乎占據(jù)整個腹腔的25％ ～30％，在飼養(yǎng)的過程中還發(fā)現(xiàn)大于八周齡的 GF級KM小鼠經(jīng)常出現(xiàn)突然死亡，這極有可能與其盲腸異常膨大且腸壁變薄有關(guān)。

無菌動物生活在無菌的隔離器環(huán)境中，用現(xiàn)有的檢測方法無任何可檢測到的微生物的影響，其免疫系統(tǒng)未被激活，作為機體重要防御系統(tǒng)的白細胞群的水平比夏介英、雷培琪［6］報道SPF級KM小鼠的低很多，而且本實驗中測出的GF級KM參與體液免疫的免疫球蛋白的水平普遍較低，這些特征決定了無菌動物有很多SPF級動物和清潔級動物不可替代的應(yīng)用［7-9］。

目前國際上無菌動物的應(yīng)用還很少，國內(nèi)沒有關(guān)于GF級KM小鼠的生物學(xué)特性數(shù)據(jù)的報道，而這些數(shù)據(jù)是實驗動物飼養(yǎng)和試驗中重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，臟器重量及臟器系數(shù)是衡量動物功能狀態(tài)的重要指標，血液生理生化正常值是生物醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)指標，是臨床醫(yī)療和科學(xué)研究的重要依據(jù)，是評價封閉群動物遺傳標準的一項重要指標［10］。對GF級KM小鼠的生長發(fā)育、臟器重量、血液學(xué)參數(shù)和生化指標進行測定，可為該無菌小鼠標準化鑒定和質(zhì)量控制提供依據(jù)，同時亦為無菌動物在我國醫(yī)學(xué)科研中的廣泛應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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