包新奇，黃紹華，劉巧榮，孫 明，楊 璐，申屠芬琴，康立平，陳西釗，4

（1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210036；2.徐州市高校獸醫(yī)站，徐州 221006；3.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100085；4.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125）

偽狂犬 （Pseudorabies）又稱奧捷士奇?。ˋujeszky＇s，AD），是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的包括多種病畜和野生動(dòng)物共患的一種急性傳染?。?］。豬是該病的自然宿主和貯存者?？梢鹑焉锬肛i的流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，新生仔豬的大量死亡。自1902年發(fā)現(xiàn)以來，偽狂犬病已在全球范圍內(nèi)流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。該病毒屬于皰疹病毒科A皰疹病毒亞科，為雙股線形DNA，約150 kb，編碼70～100種蛋白。目前已經(jīng)鑒定了 11種糖蛋白，其中 gB（glycoprotein B）是最主要的保護(hù)性抗原之一，能刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體依賴性和補(bǔ)體非依賴性的中和抗體以及病毒特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［1］。

gB基因在皰疹病毒成員中屬于最保守的糖蛋白基因，在不同的皰疹病毒之間，gB蛋白的功能可以相互取代［2］。其大小約2.8 kb，編碼913個(gè)氨基酸。擁有一段信號肽系列（N端的58個(gè)氨基酸）。成熟的gB蛋白C端有3個(gè)疏水區(qū)，其中最后一個(gè)疏水區(qū)為跨膜區(qū)（740～808 aa）。gB以二硫化物連接的三聚糖蛋白復(fù)合體的形式存在，即gBa，gBb和gBc，大小分別為855 aa（59～913 aa）、444 aa（59～502 aa）和411 aa（503～913 aa）。gBb和gBc是gBa剪切后的產(chǎn)物［4，5］。gB蛋白有多個(gè)抗原決定簇，其中59～126之間有3個(gè)連續(xù)的抗原決定簇，在214～279 aa之間有一個(gè)連續(xù)的抗原決定簇，在540～734 aa區(qū)間有8個(gè)潛在的非連續(xù)抗原決定簇，其中有兩個(gè)位點(diǎn)位于540～646 aa之間［3］。根據(jù) gB的以上特點(diǎn)，本研究將PRV的gB基因分4個(gè)片段進(jìn)行表達(dá)和鑒定，為研制豬偽狂犬病gB抗體檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株與血清

偽狂犬病毒毒株為新疆分離株，由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。感染偽狂犬病毒的陽性血清、陰性血清、22份豬血清臨床樣品均為本試驗(yàn)室保存。

1.2 載體、菌株、試劑

pGEM-T-easy、內(nèi)切酶 EcoR I和 Sal I購自Promega公司。pGEX-6P-1表達(dá)載體購自Amersham Pharmacia公司。大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。氨芐青霉素、辣根過氧化酶標(biāo)記的抗豬IgG購自Sigma公司。病毒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自 Omega公司。gB-ELISA試劑盒購自IDEXX公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)發(fā)表的gB序列（序列號：A68929），分別在氨基酸位置59～502 aa，39～155 aa、368～575 aa和540～740 aa設(shè)計(jì)4對引物，上、下游引物分別加EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)。

gB-1：PRV-Bb-F：5＇-ATAGAATTCATGGCGGCCGTG ACGCGG-3＇

PRV-Bb-R：5＇-ATTGTCGACTTAGCGCCGGGCCC GACGGGC-3＇

gB-3：PRV-59-F：5＇-ATAGAATTCATGGCGGCCGTGA CGCGG-3＇

PRV-59-R：5＇-TTTGTCGACTTAGAAGGAGTCGT AGGGGTAC-3＇

gB-4：PRV-368-F：5＇-ATAGAATTCATGCCCAAGAC GCGGCGCGT-3＇

PRV-368-R：5＇-TTTGTCGACTTAGCTGGGGTTC AGGCGCGACA-3＇

gB-5：PRV-540-F：5＇-ATAGAATTCATGATCCAGG CGCACGTGAAC-3＇

PRV-540-R：5＇-TTTGTCGACTTAGTAGAACTTG AGCGCGTGCA-3＇

4對引物分別可擴(kuò)增大小為1332 bp、714 bp、624 bp和603 bp的片段。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 擴(kuò)增及克隆

1.4.1 病毒DNA的提取：參照Omega公司的病毒DNA提取試劑盒操作說明提取PRV總DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增：程序?yàn)?5℃ 3 min，94℃ 45 s，72～52℃ 60 s，72℃ 90s，40個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。

1.4.3 PCR產(chǎn)物電泳、克隆和序列測定：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Omega公司膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物，克隆到 pGEM-T-easy，經(jīng)PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將陽性質(zhì)粒用EcoR I和Sal I進(jìn)行雙酶切，回收gB各片段，連接至經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6pgB-1、pGEX-6p-gB-3、pGEX-6p-gB-4和pGEX-6p-gB-5。轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Sal I酶切鑒定，鑒定正確的陽性質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

陽性單菌接種于LB/AMP培養(yǎng)液中，當(dāng)菌搖至OD600=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為 1 mM/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，收菌。菌體超聲破碎，4℃ 10000 r離心10 min，收集上清和沉淀。用電洗脫的方法進(jìn)行重組蛋白純化，按照文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定，同時(shí)進(jìn)行薄層掃描分析目的蛋白的表達(dá)情況。

1.7 ELISA

間接ELISA：以3種gB抗原為包被抗原建立間接ELISA方法：用方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度、最佳血清稀釋度、包被時(shí)間、二抗?jié)舛纫约胺磻?yīng)時(shí)間等。將建立的 ELISA分別命名為gB3-ELISA、gB4-ELISA和gB5-ELISA。.

臨床樣品檢測：以IDEXX公司gB-ELISA為對照，用gB3-ELISA、gB4-ELISA和gB5-ELISA檢測22份豬血清臨床樣品，評價(jià)3種抗原用于檢測豬偽狂犬gB抗體情況。

2 結(jié)果

2.1 克隆、鑒定及測序

gB基因各片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳顯示，分別可見約1330 bp、700 bp、620 bp和600 bp的4個(gè)基因片段（見圖1），大小與gB基因相符，預(yù)測證實(shí)所克隆的基因完全正確。

圖1 gB片段擴(kuò)增Fig.1 PCR products of gB

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

4種重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，分別可見約1330 bp、700 bp、620 bp和600 bp的目的基因片段。見圖2。測序結(jié)果于預(yù)期相符。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Digestion of recombinant p lasmids for prokaryotic expression with EcoR I和Sal I

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

IPTG誘導(dǎo)4h的破菌沉淀和上清經(jīng)SDS-PAGE分析，分別在75、51.9、49和48.7×103Da處出現(xiàn)目的條帶（圖3）。與gB-1、gB-3、gB-4和gB-5的理論分子量相符。4種融合蛋白主要以包涵體形式存在。薄層掃描分析顯示：gB-3、gB-4和gB-5的表達(dá)量較高，約占菌體總蛋白30％、35％和39％。gB-1的表達(dá)量較低僅占菌體總蛋白的10％（圖略）。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.4 Westernblotting鑒定

用PRV陽性血清作一抗，抗豬IgG的抗體為二抗。分別對菌體蛋白和純化蛋白進(jìn)行 Western blotting鑒定。結(jié)果表明，4種蛋白均可與陽性血反應(yīng)（圖4），由于 gB-1表達(dá)量不高，難以純化。對表達(dá)的gB-3、gB-4和 gB-5進(jìn)行了純化和鑒定。其中圖4-A為未純化的蛋白與陽性血清鑒定結(jié)果，圖4-B為純化蛋白鑒定結(jié)果。圖4-A顯示4種重組蛋白均可與陽性血清反應(yīng)，gB-1由于蛋白量低，陽性帶隱約可見，其他條帶比較清楚。

圖4 gB1、gB2、gB3和gB5重組蛋白的Western blottingFig.4 Western blotting of recombinant proteins of gB1、gB2、gB3 and gB5

2.5 ELISA檢測

用初步建立的間接ELISA方法與IDEXX公司的gB-ELISA試劑盒同時(shí)檢測22份臨床豬血清樣品。結(jié)果顯示，以gB-3，gB-4，gB-5為抗原建立的間接IELISA方法和IDEXX公司的gB-ELISA方法的符合率分別為 40.9％（9/22）、81.8％（18/22）和81.8％（18/22）。具體見表1。

3 討論

本研究依據(jù)gB蛋白有多個(gè)B細(xì)胞抗原決定簇的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)4對特異性引物，擴(kuò)增含不同抗原決定簇的基因片段進(jìn)行分段表達(dá)。尋找抗原性好的蛋白，用來制作gB抗體檢測試劑盒。結(jié)果顯示，表達(dá)的4種重組蛋白均能與PRV陽性血清反應(yīng)。其中g(shù)B-1表達(dá)量較低，gB-3，gB-4和gB-5表達(dá)量較高。

國外學(xué)者對gB的生物學(xué)功能進(jìn)行了大量研究。Favoreel等［7］發(fā)現(xiàn)gB和gD共同誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體能引起酪氨酸磷酸化依賴信號轉(zhuǎn)換途徑的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)吞作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，gB還能調(diào)節(jié)PRV的傳播，在神經(jīng)元-細(xì)胞連接點(diǎn)病毒單獨(dú)釋放時(shí)，由 gB/gH/gL組成的融合復(fù)合體通過附近并列的薄膜進(jìn)入軸突連接的細(xì)胞［8］。以gB構(gòu)建的DNA疫苗可以誘導(dǎo)豬體的細(xì)胞免疫，并且在早期感染時(shí)能夠減少病毒的排泄［9］。用桿狀病毒表達(dá)gB蛋白免疫鼠收集的抗體可以在體外中和PRV，并且免疫鼠能抵抗 PRV致死性攻擊［10］。用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的 gB蛋白建立夾心 ELISA方法，能檢測感染PRV7 d的豬血清中的gB抗體，也可檢測未感染小豬血清中的母源抗體。

我國主要免疫PRV gE缺失疫苗預(yù)防豬偽狂犬病，以檢測gE抗體來區(qū)分PRV免疫和自然感染豬。目前已有商品化的gE和gB抗體ELISA試劑盒出售，在豬偽狂犬病防控中發(fā)揮了重要作用。鄒浩勇等研究發(fā)現(xiàn)gB抗體與中和抗體具有很好的相關(guān)性［11］。gB-ELISA試劑盒檢測PRV中和抗體陽性血清，可檢測97.8％的陽性率；而gE-ELISA試劑盒只能檢出34.6％的陽性率［11］。因此，檢測豬血清中的gB抗體可用于疫苗免疫效果評估。

本研究表明，用大腸桿菌表達(dá)的不同片段的gB抗原均能與豬偽狂犬陽性血清反應(yīng)。以gB-4和gB-5重組抗原建立的ELISA方法與IDEXX公司的gBELISA試劑盒符合率均為81.8％。但是限于檢測樣品的數(shù)量較少，抗原評價(jià)可能存在差異。仍需擴(kuò)大檢測樣品數(shù)量，進(jìn)一步評估鑒定。

4 小結(jié)

首次成功對 gB基因進(jìn)行了分段表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白均能被PRV陽性血清識別。其中g(shù)B-4和 gB-5具有較好的抗原活性，適用于豬偽狂犬 gB抗體檢測試劑盒的進(jìn)一步研究。

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