于文靜，趙 靜，連 波，位曉丹，謝 斌，高志芹

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，濰坊 261053； 3.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，濰坊 261053）

大腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病 因尚未明確，但其生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后與腫瘤新生血

管生成密切相關(guān)，因此，抗腫瘤血管生成成為治療大腸癌很有希望的途徑之一，腫瘤血管生成和抗血管生成治療的研究前提是建立適合的大腸癌血管生成模型。本研究選用人大腸癌腺癌細(xì)胞株HT-29建立雞胚尿囊膜（CAM）移植模型，并觀察其建模后腫瘤血管生成特征。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 人大腸癌腺癌細(xì)胞株HT-29，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液：solarbio公司生產(chǎn)；滅菌級無支原體新生牛血清：杭州四季青生物工程材料公司；胰蛋白酶：solarbio公司。

1.1.3 種蛋 購自濰坊市第五養(yǎng)雞場。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) HT-29細(xì)胞生長于含10％滅活新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 雞胚孵育 種蛋常規(guī)消毒后，氣室端向上，置于溫度37.6℃，濕度66％的恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵育，每天轉(zhuǎn)蛋一次。自制照蛋器驗(yàn)蛋，距離胎頭下方0.5～1.0 cm處劃定開窗位置，備用。

1.2.3 CAM開窗法將發(fā)育良好的8日齡雞胚置于超凈臺消毒，用無菌眼科鑷在雞胚氣室端開小孔并穿透殼膜，以驗(yàn)蛋劃定的開窗位置為中心開1 cm× 1 cm的窗，使用無菌注射器加1滴生理鹽水濕潤卵殼膜后刺破殼膜，使CAM下塌與卵殼膜分離，去除卵殼膜后暴露CAM，制成假氣室，用無菌透明膠帶封窗備用。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞接種及實(shí)驗(yàn)分組 取指數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化，以1000 r/min離心5 min，用0.1 mol/L PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)量。取20 uL細(xì)胞懸液，加于雞胚 CAM大血管間相對無血管區(qū)域，分為6個(gè)組：PBS、1×106、2×106、4×106、8× 106、1.6×107；PBS組作為陰性對照，每組 9只雞胚。加入細(xì)胞后，用無菌透明膠帶封口，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，不再轉(zhuǎn)蛋。

1.2.5 固定取膜 接種后每天觀察雞胚存活情況及移植瘤生長情況，以胚胎活動狀況判斷雞胚存活，以肉眼觀察直徑達(dá)2 mm的實(shí)體瘤為成瘤陽性；自完成接種后每天從各組取胚，對CAM行原位數(shù)碼相機(jī)拍照，再以1∶1的甲醇和丙酮混合液固定10 min，用眼科剪剪下實(shí)驗(yàn)區(qū)的CAM，平鋪于平皿中數(shù)碼相機(jī)拍照，用計(jì)算機(jī)圖形分析系統(tǒng)處理圖像；部分標(biāo)本以中性福爾馬林原位固定10～15 m in，常規(guī)石蠟包埋、切片、行組織學(xué)檢查（HE染色）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件包，運(yùn)用 χ2檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 接種細(xì)胞數(shù)量對雞胚存活率和移植瘤成瘤率的影響

本實(shí)驗(yàn)將5個(gè)不同數(shù)量的HT-29細(xì)胞接種于雞胚尿囊膜相對無血管區(qū)，接種后繼續(xù)孵育7 d，結(jié)果顯示接種不同數(shù)量的HT-29細(xì)胞，對雞胚的存活無明顯影響，各實(shí)驗(yàn)組雞胚存活良好，1.6×107組存活率略低，接種不同數(shù)量的細(xì)胞對雞胚的存活率影響的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 在CAM上接種不同數(shù)量HT-29細(xì)胞后雞胚的存活率Tab.1 Effects of the concentrations of the tumor cells HT-29 on the embryo survival rate

當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)低于4×106時(shí)，幾乎不能成瘤；1 ×106、2×106組成瘤率為分別為0和25％，與PBS對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著接種HT-29細(xì)胞數(shù)的增加，成瘤率也相應(yīng)增加，HT-29細(xì)胞數(shù)目增加至1.6×107時(shí)，移植瘤成瘤率增加至100％，與2×106組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與接種細(xì)胞數(shù)在8×106時(shí)的成瘤率相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

2.2 移植瘤原位生長特性

接種HT-29細(xì)胞24 h后，可見種植的HT-29細(xì)胞呈淡白色貼附于雞胚尿囊膜接種區(qū)域；48 h后可見接種區(qū)域 HT-29細(xì)胞聚集，CAM透明度略有降低；72 h后發(fā)現(xiàn)瘤體，其生長速度顯著加快，體積增加明顯，有明顯的血管生成并長入接種區(qū)；96 h后可見瘤體周圍血管呈放射性生長，瘤體進(jìn)入生長高峰期，體積顯著增加，直徑可達(dá)5～7 mm；第7天以后瘤體增加速度變緩，第8天伴隨尿囊膜血管網(wǎng)的衰退，瘤體生長開始呈現(xiàn)衰退，瘤體體積未見明顯變化。

表2 在CAM上接種不同數(shù)量HT-29細(xì)胞的成瘤率Tab.2 Effects of the concentrations of the formation rate of the transplantation tumor

2.3 大腸癌移植模型血管生成特征

接種HT-29細(xì)胞24 h內(nèi)，除CAM血管網(wǎng)正常發(fā)育外，未見明顯血管變化；48 h后可見較弱的血管反應(yīng)，部分雞胚可見少量較細(xì)的血管向接種區(qū)生長；接種 HT-29細(xì)胞72 h后，CAM上血管明顯增粗、增多，排列紊亂，可觀察到CAM上血管向瘤體集中，部分長入瘤體；第4天可見血管以新生瘤體為中心放射狀排布，部分血管粗大、盤曲。第5天時(shí)進(jìn)入生長高峰，與第1天比較血管數(shù)目差異顯著；以后每天血管數(shù)目都在增加，至第8天，伴隨著尿囊膜血管網(wǎng)的衰退，以瘤體為中心選定范圍內(nèi)的血管數(shù)目有明顯下降。（彩插3圖1，2）

2.4 大腸癌雞胚尿囊膜移植模型的組織細(xì)胞學(xué)特征

常規(guī)石蠟切片、HE染色，光鏡下可見模型瘤體組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)與人大腸癌腺癌組織標(biāo)本結(jié)構(gòu)相似。腫瘤細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，體積大，可見瘤巨細(xì)胞，細(xì)胞胞漿少，核大深染，異型性明顯，核分裂相常見。部分腫瘤細(xì)胞形成腺管樣組織。瘤體周圍可見新生血管及淋巴管（彩插3圖3）。

3 討論

腫瘤血管生成及抗血管生成研究中有多種體內(nèi)、體外模型被廣泛應(yīng)用，體外模型由于缺乏腫瘤生長及其血管環(huán)境的模擬，往往需要結(jié)合適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)模型。CAM移植瘤模型是應(yīng)用較廣泛的體內(nèi)研究模型［1，2］，本研究將人大腸癌腺癌細(xì)胞株 HT-29接種到CAM上，摸索HT-29的建模條件，成功建立大腸癌腺癌CAM移植瘤模型，從蛋殼開窗處可觀察到移植模型瘤體的生長過程及血管生成特征，效果直觀。且實(shí)驗(yàn)過程中對儀器設(shè)備條件要求不高，實(shí)驗(yàn)周期短，故CAM是研究腫瘤血管生成及抗血管生成抑制劑的良好動物模型，可應(yīng)用于大腸癌腺癌的血管生成及抗血管生成治療研究。

但不同的腫瘤類型、不同腫瘤細(xì)胞株在CAM移植瘤模型建立過程中的條件和成功率均有不同。其成功率受開窗方法、載體選擇、開窗時(shí)間、細(xì)胞接種數(shù)量/密度等很多因素的影響［3］，在模型建立之前應(yīng)綜合考慮各方面因素，以保證實(shí)驗(yàn)的成功率。本研究中HT-29細(xì)胞在培養(yǎng)中呈島樣生長，增殖活躍，細(xì)胞的接種數(shù)量對移植瘤模型成瘤率有明顯影響。但應(yīng)同時(shí)考慮接種細(xì)胞數(shù)量實(shí)驗(yàn)雞胚的成活率及實(shí)驗(yàn)的可操作性的影響，成瘤率達(dá)100％的1.6 ×107組，在批量建模時(shí)會增加細(xì)胞培養(yǎng)的工作量和難度。模型應(yīng)用時(shí)所選擇的合適的腫瘤細(xì)胞數(shù)量級應(yīng)綜合考慮成活率、成瘤率及實(shí)驗(yàn)的可操作性，既可保證較高的成瘤率，又不至于因癌細(xì)胞數(shù)量太大而增加實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān)，依本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8×106為HT-29細(xì)胞CAM移植模型的理想接種數(shù)量。

有研究發(fā)現(xiàn)接種時(shí)所選擇的雞胚日齡也對模型建立的成功率存在影響［4］，實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)過小的雞胚如還處于“單珠期”，胚胎的活動度較大，接種點(diǎn)很難固定，常常會轉(zhuǎn)移位置，對實(shí)驗(yàn)效果及觀察有很大影響，且胚齡小時(shí)對實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度的要求較高，開窗后死亡率也較高。隨胚齡增長，雞胚開窗后的成活率會明顯增加，但雞胚胚齡太大時(shí)其在蛋殼內(nèi)所占空間較大，CAM也開始出現(xiàn)退化，且雞胚孵育周期只有21 d，對建模后的應(yīng)用限制較大，故不宜過晚接種。綜合雞胚發(fā)育狀態(tài)、血管形成特征及實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枨蟮榷喾N因素，HT-29細(xì)胞CAM接種的理想胚齡為第7～9天。此外，建模成功的實(shí)驗(yàn)中無菌操作也很關(guān)鍵，有學(xué)者建議滴加含抗生素的液體預(yù)防感染。但若能保證嚴(yán)格的無菌操作可以保證實(shí)驗(yàn)的成功率，還可避免預(yù)防性滴加的抗生素對細(xì)胞生長和后期藥物干預(yù)的影響。

實(shí)驗(yàn)中觀察到，血管反應(yīng)先于移植模型瘤體的生長，符合 Folkman［5，6］的腫瘤血管新生理論，瘤體生長過程在一定程度上依賴于新生血管輸送營養(yǎng)，出現(xiàn)明顯血管反應(yīng)后，腫瘤新生的血管保證了瘤體生長的高峰期，伴隨CAM的血管生成衰退，腫瘤血管生成也會出現(xiàn)衰退，且瘤體生長停止。CAM移植模型的主要缺陷也在于其建模后最長14 d的可觀察的實(shí)驗(yàn)周期。但作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，取自人結(jié)腸癌腺癌的細(xì)胞株HT-29的CAM移植模型瘤體經(jīng)常規(guī)固定、石蠟切片、HE染色結(jié)果顯示很好的保留了大腸癌腺癌的組織細(xì)胞學(xué)特征，增加了對其生物學(xué)行為干預(yù)研究的可信度。

將HT-29細(xì)胞直接種到雞胚尿囊膜上建立移植模型，可用于研究大腸癌生長特性、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤化療藥物篩選和放射敏感性等多種研究［7，8］，尤其適用于腫瘤血管生成因子及藥物的篩選及研究，為大腸癌抗血管生成治療研究提供一個(gè)良好的模型。

［1］Ribatti D，Vacca A，Roncali L，et al.The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on angiogenesis［J］.Int JDev Biol，1996，40：1189-1197.

［2］Tufan AC， Satiroglu-Tufan， NL. The chick embryo chorioallantoic membrane as amodel system for the study of tumor angiogenesis，invasion and development of anti-angiogenic agents［J］.Current Cancer Drug Targets，2005，5（4）：249-266.

［3］Sergio UD，Rachel E.A model system for testing gene vectors using murine tumor cells on the chorioallantoic membrane of the chick embryo［J］.GenetMol Res，2002，1（2）：167-175.

［4］Jianping Wang，Lihong Wang，Lin Cai.Establishment of a transplantation tumor model of human osteosarcoma in chick embryo［J］.Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2009，8（9）：531-536.

［5］胥明，蔣海飚，王興鵬.人胰腺癌雞胚模型的建立及其腫瘤生物學(xué)觀察［J］.消化外科，2005，3（2）：101-104.

［6］班立麗，李瑪琳，張慧等.人肝癌雞胚尿囊膜移植瘤及其血管生成模型的建立［J］.肝膽外科雜志，2009，17（3）：229 -231.

［7］Walter JM，Mark LK，Angela P，et al.A novel technique for quantitifying changes in vascular density endothelial cell proliferation and protein expression in response to modulators of angiogenesis using the chick chorioallantoic membrane（CAM） assay［J］.Journal of translationalmedicine，2004，2：4.

［8］Li YJ，Wang D，Zhou Y.Observation of the microstructure and ultrastructure ofmicrovessels induced by OS-732 cell line［J］.J First Mil Med Univ（Chinese），2002，22：127-129.