王偉玲，楊寶學

（北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，分子心血管學教育部重點實驗室，北京 100191）

腎臟發(fā)育是一個極其精細的過程，發(fā)育的不同階段形成不同的器官（如前腎，中腎，后腎），后腎的發(fā)育起始于輸尿管芽的形成，當輸尿管芽頂端侵入后腎間充質(zhì)，輸尿管芽和后腎間充質(zhì)相互誘導，按時空順序依次表達相應(yīng)基因，釋放轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、細胞因子、細胞外基質(zhì)和黏附分子，促使后腎發(fā)育成熟。

GDNF及其受體

膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族的一個亞家族中的一員，屬于半胱氨酸蛋白家族。GDNF亞家族受體由兩部分構(gòu)成，一部分為跨膜受體 RET，另一部分共同受體GFRα1-4（GDNF fam ily receptor）可與GDNF家族成員高度親和結(jié)合。受體與配體結(jié)合后激活以下通路：Ras/ERK、三磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3-kinase）、磷脂酶 C （phospholipase C gamma，PLCr）［1］，對輸尿管芽生長和分支形態(tài)發(fā)生都有促進作用。

Gdnf-/-，Ret-/-，或者Gfrα1-/-的小鼠不能形成正常的輸尿管芽，腎臟發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育［2］，證明了GDNF在誘導輸尿管芽出芽方面發(fā)揮重要作用。對Ret-/-和野生型細胞的嵌合體研究顯示野生型細胞集中在輸尿管芽頂部，而Ret-/-突變型細胞較少［3］，提示 GDNF/Ret信號還具有促 ND細胞遷移的能力。RET激活后誘導Wnt11在輸尿管芽頂端表達，而Wnt11進一步誘導間充質(zhì)中GDNF的表達［4］。另一個被RET調(diào)節(jié)的基因是Sprouty1（Spry1），在輸尿管芽生長和分支形成中起到負反饋調(diào)節(jié)作用。有趣的是 Gdnf-/-，Spry1-/-或Ret-/-，Spry1-/-的小鼠腎臟發(fā)育正常，而Gdnf-/-或Spry1-/-小鼠腎臟發(fā)育顯著異常，初步的研究證明正常情況下GDNF和FGF均受Spry1抑制，但GDNF誘導輸尿管芽出芽和延伸的作用占主要地位，當 GDNF和 Spry1敲除后FGF的抑制解除，得以發(fā)揮功能，從而能夠形成正常的 腎 臟。然 而Gdnf-/-，Spry1-/- 或Ret-/-，Spry1-/-的小鼠與野生型小鼠和Spry1單敲小鼠在分支形態(tài)發(fā)生存在顯著不同，揭示了GDNF在分支形態(tài)發(fā)生過程中的特異性作用［5］。還有一種抑制GDNF信號的分子是臂板蛋白（class 3 semaphorins，Sema3），抑制GDNF的表達和RET的磷酸化，敲除了Sema3a引起腎臟體積的短暫性增大，UB分支形成增多，在組織培養(yǎng)條件下過表達Sema3a后則產(chǎn)生相反的效果［6］。

Microarray技術(shù)檢測還發(fā)現(xiàn)了其他 GDNF/Ret下游的蛋白，包括趨化因子受體 Cxcr4，趨化因子Crlf1，信號抑制因子 Dusp6和 Spred2，轉(zhuǎn)錄因子Myb，Etv4，Etv5［7］，這些蛋白的作用還有待于進一步研究。最近對嵌合體的研究顯示野生型細胞分布于輸尿管芽頂端，而Etv4-/-，Etv-/-的細胞分布在輸尿管芽頂端之外的部位，與Ret-/-的細胞分布范圍類似，Etv4-/-，Etv5-/-的細胞分布更加局限，提示Etv4，Etv5可能是多個通路的下游［8］。

故一旦出芽成功，GDNF經(jīng)正反饋環(huán)促進新芽不斷生長分支，分支到一定程度，GDNF又可經(jīng)負反饋環(huán)，減慢輸尿管芽分支，調(diào)節(jié)輸尿管芽數(shù)量和大小。

FGF及其受體

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）是由 150～200個氨基酸組成的細胞間的信號分子，在各種器官胚胎的形態(tài)發(fā)生和細胞分化過程中起著重要的作用。FGF與其膜受體FGFR結(jié)合后，F(xiàn)GFR發(fā)生二聚體化，激活其下游的信號通路： PLCγ途徑；Ras/Raf/MEK/ERK途徑；JAK/STAT途徑；PI3-kinase，以上 4條路徑相互作用形成復雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制。

FGF7和 FGF10表達于間充質(zhì)細胞，以高親和力與FGFR2b結(jié)合，激活下游信號通路，調(diào)節(jié)輸尿管芽生長和腎單位形成的數(shù)量。FGFR2等位基因在輸尿管芽特異性敲除，腎臟體積顯著性減小，輸尿管芽分支少、腎單位少、輸尿管芽莖柄稀而細。缺乏 FGF7或 FGF10小鼠的腎臟明顯小于正常小鼠，離體的輸尿管芽培養(yǎng)系統(tǒng)顯示 FGF7引起的輸尿管芽以緊湊的方式分支，無明顯的莖柄和壺腹，F(xiàn)GF10則刺激形成長莖柄和明顯的壺腹。FGF8 mRNA在胚胎12 d的腎臟開始表達，條件敲除掉間充質(zhì)FGF8導致嚴重的腎發(fā)育不全［9］。這些結(jié)果表明FGF系列生長因子對于輸尿管芽分支形成是重要的。

最近的研究顯示FGFR1能夠與Spred1的SPR結(jié)構(gòu)域和Sprouty/Spred家族中成員相連，起到抑制Ras/Raf/ERK的作用，同時 Spred能夠延長 FGFR1在細胞膜上的保留時間，使其與配體充分作用［10］，提示FGF信號與GDNF存在重疊與相互作用。而Gdnf或 Ret單敲小鼠腎臟發(fā)育顯著異常，在Gdnf或Ret單敲的基礎(chǔ)上去除Spry后，腎臟能夠正常發(fā)育，但是這種逆轉(zhuǎn)作用在敲除Fgf10后消失了，也就是說Gdnf-/-，Spry1-/-，F(xiàn)gf10-/-小鼠腎臟發(fā)育不全，F(xiàn)GF10發(fā)揮作用并不依賴GDNF，提示還存在其他信號通路調(diào)控［5］。

HGF及其受體

肝細胞生長因子 （hepatocyte growth factor，HGF）屬于酪氨酸激酶受體超家族的一員，1991年，Bottaro［11］通過251I標記的 HGF與細胞蛋白的共價交聯(lián)直接證明C-MET為HGF的受體。胚胎11 d腎間充質(zhì)細胞即有HGF和C-MET的表達，HGF與受體 Met特異結(jié)合后，可誘導Met上的酪氨酸磷酸化，激活細胞內(nèi)多個信號通路，包括 PLC、Ras、ERK1/2和 PI3-kinase等途徑，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和遷移。

Vargas［12］發(fā)現(xiàn) HGF能夠刺激后腎間葉細胞向上皮分化，同時在輸尿管芽的管狀形態(tài)發(fā)生中起重要作用。Montesano等［13］證實 HGF可誘導膠原凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中的犬腎細胞（madine darby canine kidney，MDCK）形成管狀結(jié)構(gòu)。研究表明，HGF經(jīng)MET介導的 PI3-kinase激活可誘導內(nèi)髓集合管上皮細胞（m IMCD-3）增殖、遷移和分支，對于趨化現(xiàn)象和集合管形成起重要作用。Akashi Togawa［14］的研究顯示HGF能夠上調(diào)Cdc42的表達量使細胞間緊密連接蛋白降解，促進MDCK細胞遷移，進一步的實驗證明HGF的這種作用是依賴Erk通路的。

BM P及其受體

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）為轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族中的一大亞類，自從上世紀90年代最早報道了Bmp7基因缺失的小鼠腎發(fā)育不全［15］，關(guān)于 BMP在腎發(fā)育過程中作用成為研究熱點，揭示了BMP在中腎管的形成、輸尿管芽的形成、分支形態(tài)發(fā)生、腎單位祖細胞的存活和增殖等過程發(fā)揮重要作用。

BMP2在輸尿管芽周的間充質(zhì)組織中表達，腎組織培養(yǎng)和輸尿管芽離體培養(yǎng)實驗顯示 BMP2可抑制輸尿管芽生長分支。BMP4和BMP5參與集合管后階段腎盂和輸尿管的發(fā)育調(diào)控，BMP4主要在中腎和輸尿管周圍間充質(zhì)組織中表達，對抗后腎間充質(zhì)釋放的誘導信號GDNF，抑制Wnt11表達，從而抑制中腎管不適宜位點萌芽，減少中腎異位輸尿管分支的數(shù)目以及增加輸尿管形態(tài)的延長，體外實驗表明，外源BMP4同樣抑制輸尿管芽的形成，證實這一因子有能力直接影響輸尿管芽分支形態(tài)形成［16，17］。BMP7是胚胎腎發(fā)育的重要的誘導因子，表達于后腎間充質(zhì)及輸尿管芽及其衍生物 ，低濃度BMP7通過p38絲裂原活化蛋白激酶促進輸尿管芽分支形成，高濃度則抑制分支形成［18］。在體內(nèi)，BMP7主要起到抑制間充質(zhì)細胞的過度增生的作用，從而協(xié)調(diào)輸尿管芽分支和小管上皮的形成［19］。GREMLIN1（GREM1）是內(nèi)源的 BMP4拮抗劑，Alexandre Goncalves的研究顯示 GREM1還能拮抗BMP7，Grem1敲除小鼠腎發(fā)育不全，但給予外源BMP4或BMP7抑制劑后則能形成正常的腎臟［20］。

細胞外基質(zhì)

細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）是胚胎發(fā)育過程中主要有間充質(zhì)細胞合成并分泌的大分子物質(zhì)，包括纖維性成分 （膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白）、連接蛋白（纖維粘連蛋白、層粘連蛋白）和空間充填分子 （主要為糖胺聚糖），對細胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。

體外實驗顯示，在純基質(zhì)膠中培養(yǎng)，IMCD細胞可形成多細胞包囊，在Ⅰ型膠原中培養(yǎng)，IMCD細胞則形成實心分支索，在膠原和基質(zhì)膠混合凝膠中培養(yǎng)，IMCD細胞形成中空分支管狀結(jié)構(gòu)，由此可見，細胞與基質(zhì)相互作用在上皮組織結(jié)構(gòu)形成過程中起重要作用［21］。研究這些基質(zhì)成份發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白能促進成年小鼠的 IMCD形成分支管狀結(jié)構(gòu)，Ⅳ型膠原和玻連蛋白則起到抑制作用［9］。最近的研究顯示纖連蛋白能夠誘導上皮細胞產(chǎn)生Btbd7蛋白，Btbd7蛋白進而上調(diào)Snail2，抑制E-鈣黏蛋白表達，促進芽體裂隙的形成，體外實驗證明Btbd7具有促進MDCK細胞遷移的功能［22］。

由于輸尿管芽形成過程涉及細胞增殖、遷移、擴展，當細胞絲狀偽足向外延伸時，需要降解周圍的基質(zhì)，作為降解細胞外基質(zhì)的主要降解酶—基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在分支形態(tài)發(fā)生過程同樣發(fā)揮重要作用。Catherine Arnould［23］的研究顯示 Mmp9-/-小鼠腎臟發(fā)育延遲，體內(nèi)體外實驗顯示MMP9缺失后Caspase3表達上調(diào)，細胞凋亡增加，表明在腎臟發(fā)育階段 MMP9抑制間充質(zhì)細胞凋亡。Mmp14-/-的小鼠腎臟發(fā)育過程中不能進行正常的分支形態(tài)發(fā)生。此外，MMP14能夠使ECM重構(gòu)從而誘導分支形態(tài)發(fā)生，促進BMP的表達或自分泌形式促進細胞遷移［24］。

整合素

作為許多 ECM的受體，整合素（integrin）在胚腎發(fā)育過程中的作用不可忽視。整合素屬于細胞表面受體，α，β亞基以非共價鍵結(jié)合，介導細胞與細胞外基質(zhì)相互作用，其細胞外區(qū)與特異的細胞外基質(zhì)成份（如：Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白）結(jié)合，促進細胞粘附，其胞內(nèi)區(qū)可將生物信號傳導至細胞內(nèi)參與細胞的分裂、增殖。

整合素能夠誘導MDCK細胞和腎形成分支［25］。用抗體阻斷整合素的功能后，髓質(zhì)集合管的形成受阻，證實整合素在髓質(zhì)集合管形成過程中是不可缺的重要中介物［21］。

當在輸尿管芽特異性敲除整合素 α3亞基，腎乳頭不能形成或形成異常［26］。整合素α8在間充質(zhì)細胞呈極性分布，α8缺失小鼠的輸尿管芽不能形成分支，同時間充質(zhì)細胞也不能轉(zhuǎn)化為上皮細胞。β1在胚胎10.5 dUB頂端表達，Hox b7/Cre小鼠特異性敲除整合素 β1后腎臟分支形成異常，在出生后發(fā)生進行性腎損傷，并出現(xiàn)水通道蛋白AQP2表達的減少［25］。研究發(fā)現(xiàn)，由 FGF介導的經(jīng)典的信號途徑也需要整合素 β1的參與。在 β1整合素敲除而FGFR維持正?；钚缘那闆r下，F(xiàn)GF信號依舊有所減弱［25］，因此，整合素β1除了在粘附和細胞遷移方面發(fā)揮其經(jīng)典作用之外，在輸尿管芽分支形態(tài)發(fā)生中也起到介導某些生長因子信號傳導的作用。

粘附相關(guān)蛋白

介導細胞間粘附的分子，鈣黏蛋白和整合素發(fā)揮著主要作用，與細胞分裂、遷移、分化和凋亡緊密相關(guān)，在維持實體組織形成以及在生長發(fā)育過程中細胞選擇性相互聚集、重排有重要作用［27］。

鈣黏蛋白是一類鈣離子依賴的粘附分子家族，在腎臟發(fā)揮過程中有許多鈣黏蛋白的表達，輸尿管芽上主要表達E-鈣黏蛋白，而在間充質(zhì)鈣黏蛋白種類存在一定的轉(zhuǎn)換［28］，鈣黏蛋白的胞漿部分與catenin相互作用，主要調(diào)節(jié)細胞骨架和信號通路轉(zhuǎn)導，敲除E-鈣黏蛋白的MDCK細胞3D培養(yǎng)條件下形成大量囊泡而非小管樣結(jié)構(gòu)［28］。Clara Martinea-Rico等［29］將磁珠用纖連蛋白和多聚賴氨酸分別包備，與 S180細胞或過表達 E-鈣黏蛋白的細胞共孵育，而后使用雙針檢測技術(shù)（dual pipette assay）檢測將磁珠和細胞分離開的作用力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達E-鈣黏蛋白的細胞與纖連蛋白包備的磁珠作用力最大，也就是說E-鈣黏蛋白與纖連蛋白產(chǎn)生的粘附作用最強，提示鈣黏蛋白在介導細胞—基質(zhì)間相互作用發(fā)揮一定作用。

還有一些蛋白雖然不屬于粘附因子，但起到細胞黏附的作用，比如 Kif26b，屬于驅(qū)動蛋白家族，作為Sall1的下游調(diào)節(jié)間充質(zhì)細胞間的粘附，在胚胎10.5 d于后腎間充質(zhì)表達。Kif26b-/-的間充質(zhì)細胞與輸尿管芽細胞間的緊密連接減弱，整合素α8分布的極性也減弱，導致間充質(zhì)的GDNF減少，過表達Kif26b使細胞間粘附增強［30］。

結(jié)語

胚胎腎的發(fā)育受多種因素的制約和調(diào)節(jié)（圖1），盡管已經(jīng)知道上述因素能影響胚胎腎的發(fā)育，但還有很多機制尚不清楚。大量研究顯示成熟腎臟在病理狀態(tài)下高表達的分子，在腎臟發(fā)育過程中也高表達，而且細胞表型的改變類似于胚胎腎發(fā)育過程中后腎間充質(zhì)細胞向上皮細胞轉(zhuǎn)分化的逆過程，提示腎臟損傷后細胞的再生過程和腎臟胚胎發(fā)育過程有著極其密切的關(guān)系，對腎發(fā)育的研究也有助于理解后天性腎臟疾病發(fā)生的病理生理機制。

圖1 胚胎腎分支形態(tài)發(fā)生調(diào)控因素Fig.1 Regulation of branchingmorphogenesis in kidney development

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