楊梁，呂德成，鄭連杰，王朝暉，張偉，李曉天

不同劑量FTY720對大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3表達及細胞凋亡的影響①

楊梁1，呂德成2，鄭連杰1，王朝暉1，張偉3，李曉天3

目的 比較不同劑量FTY720對大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3的表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法雌性SD大鼠200只，隨機分為5組，每組40只。A組大鼠不打擊脊髓，縫合切口后立即以0.3 ml生理鹽水灌胃。B、C、D、E組大鼠制作Allen's T9脊髓損傷模型。B組造模后立即以0.3 ml生理鹽水灌胃，C、D、E組分別以FTY720按1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg生理鹽水稀釋至0.3 ml灌胃。分別于術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取損傷段脊髓超薄切片，行SP免疫組化染色觀察Caspase-3表達及TUNEL染色觀察細胞凋亡情況，并計算相應(yīng)時間點免疫組化學(xué)染色陽性細胞比值。結(jié)果A組各時間點幾乎見不到Caspase-3和細胞凋亡陽性表達。B、C、D、E組均在傷后6 h開始出現(xiàn)凋亡細胞表達，傷后24 h達高峰，傷后48 h開始減弱，傷后72 h進一步減少。傷后各時間點細胞凋亡表達均為B組＞C組＞D組=E組(P＞0.05)＞A組(P＜0.05)。Caspase-3表達與細胞凋亡同步。相關(guān)性檢驗顯示B、C、D組中，F(xiàn)TY720的劑量與Caspase-3表達、細胞凋亡表達呈負相關(guān)(P＜0.05)。D組和E組中，F(xiàn)TY720劑量與上述指標不相關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論FTY720可以顯著減少大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3的表達及神經(jīng)細胞凋亡。FTY720的劑量與其減輕Caspase-3表達和細胞凋亡效果之間存在一定量效關(guān)系。3 mg/kg是FTY720治療大鼠急性脊髓損傷的最適劑量。

FTY720；Caspase-3；凋亡；脊髓損傷；神經(jīng)再生；劑量；量效關(guān)系

FTY720是一種來源于冬蟲夏草的新型免疫抑制 劑[1]，因其毒副作用小，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前對FTY720的研究主要集中于器官移植和自身免疫性疾病的治療[2-3]。近來發(fā)現(xiàn)FTY720對脊髓損傷有效[4]，在我們先前的研究中證實FTY720可以減輕大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3的表達及神經(jīng)細胞凋亡[5]。但是對于FTY720的劑量與脊髓保護作用之間是否存在量效關(guān)系，以及FTY720治療脊髓損傷的最適劑量方面還缺少相關(guān)研究。本次實驗旨在比較不同劑量FTY720對大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3的表達及神經(jīng)細胞凋亡的差別，了解FTY720的劑量與治療效果之間是否存在量效關(guān)系，摸索FTY720治療大鼠急性脊髓損傷的最適劑量，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 雌性SD大鼠200只，體重180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[合格證編號：SCXK(遼)2008-0002]。FTY720：武漢遠城科技發(fā)展有限公司；Caspase-3抗體Caspase3(CPP32)Ab-4： 美 國 NeoMarkers For Lab Vision Corporation；TUNEL試劑盒：德國Roche Diagnostics GmbH Mannheim；SP試劑盒(即用型，內(nèi)含H2O2、5%羊血清、羊抗兔多克隆抗體、過氧化物酶)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 脊髓損傷模型制作及實驗分組 大鼠稱重后，隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組40只。以2%水合氯醛60 mg/kg腹腔內(nèi)麻醉、固定、消毒，切除T9棘突及椎板。A組(假手術(shù)組)大鼠不打擊脊髓，縫合切口后立即以0.3 ml生理鹽水灌胃。B、C、D、E組大鼠以Allen's動物脊髓打擊器制作脊髓損傷模型，打擊能量5 g×5 cm，打擊面積2.5×1.5 mm，打擊后大鼠迅速出現(xiàn)搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動，雙后肢呈遲緩性癱瘓表明造模成功。B組造模后立即以0.3 ml生理鹽水灌胃，C、D、E組造模后分別立即以FTY720按1 mg/kg、3 mg/kg、5mg/kg生理鹽水稀釋至0.3 ml灌胃。術(shù)后各組大鼠分籠飼養(yǎng)，定時按壓下腹部促進排尿。

1.3 取材及切片制備 各組實驗大鼠分別于術(shù)后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取材，每個時間點8只。2%水合氯醛(60 mg/kg)腹腔內(nèi)麻醉大鼠，以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L pH7.4 PBS液50 ml心臟灌注，取損傷區(qū)為中心損傷段脊髓長約1 cm，并從損傷區(qū)中心切為兩段，任取一段置于4%多聚甲醛0.1 mol/L pH7.4 PBS液中固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，每隔10張切片取兩張(一張用于免疫組化，另一張用于細胞凋亡染色)，每份標本共取10張切片，備用。

1.4 檢測指標

1.4.1 SP免疫組化檢測Caspase-3 切片脫蠟，0.01 mol/L PBS 沖洗 3 min，共 2次，3%H2O2室溫 10～15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS沖洗3 min，共2次，0.01 mol/L CB緩沖液pH6.0微波修復(fù)100℃10 min，自然冷卻后取片，0.01 mol/L PBS沖洗3 min，共2次，加5%羊血清蛋白封阻，室溫10～15 min，傾去，加兔抗Caspase-3多克隆抗體(1∶50)，4℃過夜(18 h以上)，0.01mol/L PBS沖洗3 min，共3次。加羊抗兔多克隆抗體(即用型)，37℃15～20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3 min，共3次，加過氧化物酶37 ℃ 15～20 min，0.01 mol/L PBS 沖洗 3 min，共 3次，DAB顯色5～10 min，流水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染10 s，脫水、透明、封固[7-8]。

切片攝片后，將圖像輸入計算機，每張切片選取5個不重復(fù)脊髓損傷區(qū)域高倍視野圖像，使用Image-pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別計數(shù)免疫組化陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算Caspase-3表達陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的比值(每個標本Caspase-3表達陽性細胞數(shù)/每個標本細胞總數(shù)×100%)。

1.4.2 TUNEL染色細胞凋亡檢測 切片脫蠟，0.01 mol/L PBS沖洗5 min，3%H2O2室溫10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS沖洗5 min，共2次，0.01 mol/L CB緩沖液(pH 6.0)200 ml中，微波修復(fù)1 min，加入80 ml雙蒸水，自然冷卻，0.01 mol/L PBS沖洗5 min，加5%羊血清蛋白封阻，室溫30 min，0.01 mol/L PBS沖洗5 min，共2次，加TUNEL反應(yīng)液，37℃避光1 h，0.01 mol/L PBS沖洗5 min，共3次，避光，多功能顯微鏡觀察免疫熒光陽性表達，并攝片，加POD 37℃30 min，0.01 mol/L PBS沖洗5min，共3次，DAB顯色5～10 min，流水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染3 s，流水返藍10 min，脫水、透明、封固[9-10]。

將TUNEL染色圖像輸入計算機，每張切片選取5個不重復(fù)脊髓損傷區(qū)域高倍視野圖像，Image-pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別計數(shù)TUNEL染色陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算每個標本細胞凋亡指數(shù)(TUNEL陽性表達細胞數(shù)/每個標本細胞總數(shù)×100%)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。多組比較采用單因素方差分析，LSD法多重組間比較，相關(guān)性檢驗采用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

200 只大鼠均進入最終結(jié)果分析。E組大鼠在造模后1 d有2只出現(xiàn)血尿。

2.1 Caspase-3的表達 大鼠急性脊髓損傷后，脊髓損傷區(qū)的Caspase-3陽性細胞數(shù)量隨時間增加，至24 h達到高峰，而后隨時間下降。經(jīng)FTY720治療的大鼠個別細胞在損傷后6 h即表達Caspase-3，12～24 h Caspase-3陽性細胞數(shù)量達高峰，而后隨時間下降，72 h恢復(fù)至正常水平。急性脊髓損傷大鼠在傷后24 h內(nèi)Caspase-3表達主要集中在灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元，48～72 h神經(jīng)元Caspase-3表達減少而損傷區(qū)周邊的小膠質(zhì)細胞胞漿表達Caspase-3增加。傷后6 h至48 h各時間點各組間Caspase-3表達陽性細胞比值兩兩比較均為B組＞C組＞D組=E組(P＞0.05)＞A組(P＜0.05)。傷后72 h A組和D、E組Caspase-3表達陽性細胞比值無顯著性差異(P＞0.05)，均小于 B、C 組(P＜0.05)?？梢奆TY720可以減少脊髓損傷后細胞內(nèi)Caspase-3表達，并縮短Caspase-3表達的時間。Caspase-3陽性表達細胞呈黃褐色。見表1、圖1。

表1 Caspase-3表達陽性細胞數(shù)比例(%)

2.2 細胞凋亡

2.2.1 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色觀察A組各時間點幾乎見不到凋亡細胞。B、C、D、E組均在傷后6 h開始出現(xiàn)凋亡細胞表達，傷后24 h達高峰，傷后48 h開始減弱，傷后72 h進一步減少。傷后各時間點細胞凋亡表達均為B組＞C組＞D組=E組(P＞0.05)＞A組(P＜0.05)。各組傷后24 h以前凋亡細胞表達主要集中在灰質(zhì)區(qū)的神經(jīng)細胞，胞核明顯黃染，染色依時間逐漸加深；傷后48 h及72 h，神經(jīng)元細胞凋亡減少而損傷區(qū)周邊的小膠質(zhì)細胞凋亡增加。見表2、圖2。

表2 各組凋亡指數(shù)(%)

2.2.2 TUNEL染色過程中的免疫熒光結(jié)果 免疫熒光結(jié)果同TUNEL染色結(jié)果一致。免疫熒光及TUNEL免疫組化染色結(jié)果均顯示FTY720可以明顯減少脊髓損傷后的細胞凋亡。見表3、圖3。

表3 各組免疫熒光陽性細胞數(shù)量

相關(guān)性檢驗顯示，B組(0 mg/kg)、C組(1 mg/kg)、D組(3 mg/kg)中，F(xiàn)TY720的劑量與Caspase-3表達(r=-0.606,P＜0.05)、細胞凋亡表達(r=-0.553,P＜0.05)呈負相關(guān)。D組(3 mg/kg)和E組(5 mg/kg)中，F(xiàn)TY720劑量與Caspase-3表達(r=0.052,P＞0.05)、細胞凋亡表達(r=0.017,P＞0.05)無相關(guān)性。

圖1 脊髓損傷24 h Caspase-3 表達(SP 免疫組化染色，400×)

圖2 脊髓損傷24 h細胞凋亡結(jié)果(TUNEL 染色，400×)

圖3 凋亡細胞(TUNEL 染色過程中的免疫熒光，200×)

3 討論

本實驗的結(jié)果顯示，C、D、E三組各時間點Caspase-3表達和細胞凋亡均低于B組(P＜0.05)，進一步證實FTY720可以減少大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3表達和細胞凋亡。

同時本實驗的結(jié)果還顯示，B、C、D三組，隨著FTY720的劑量由0 mg/kg增加至3 mg/kg，各組各時間點Caspase-3表達、細胞凋亡表達均逐漸下降(P＜0.05)。D組和E組之間，隨著FTY720的劑量由3 mg/kg增加至5 mg/kg，兩組各時間點上述指標之間無顯著性差異(P＞0.05)。并且E組(5 mg/kg)出現(xiàn)血尿等副反應(yīng)。

相關(guān)性檢驗顯示，B組(0 mg/kg)、C組(1 mg/kg)、D組(3 mg/kg)中，F(xiàn)TY720的劑量與Caspase-3表達、細胞凋亡表達之間呈負相關(guān)(P＜0.05)。D組(3 mg/kg)和E組(5 mg/kg)中，F(xiàn)TY720劑量與上述指標不相關(guān)(P＞0.05)。說明FTY720的劑量與其減輕Caspase-3表達和細胞凋亡效果之間存在一定量效關(guān)系。3 mg/kg是FTY720治療大鼠急性脊髓損傷的最適劑量。在劑量小于3 mg/kg時，隨著FTY720劑量的增大，其減輕Caspase-3表達和細胞凋亡效果作用越強；在劑量大于3 mg/kg時，再增加劑量，其減輕Caspase-3表達和細胞凋亡效果不再增加，反而增加了副反應(yīng)。

FTY720主要通過抑制淋巴細胞從次級淋巴組織中游出和在胸腺積極競爭S1P受體，使外周循環(huán)的淋巴細胞進入淋巴結(jié)，從而減少外周血淋巴細胞計數(shù)，來發(fā)揮其功能的[11]。我們推斷產(chǎn)生這種量效關(guān)系的原因可能是，大鼠急性脊髓損傷后，使用3 mg/kg的FTY720治療，已經(jīng)達到抑制淋巴細胞浸潤的極致，再增加劑量不能增加其對淋巴細胞的抑制作用，從而不能進一步保護脊髓功能。

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Effects of Different Doses of FTY720 on Expression of Caspase-3 and Neural Apoptosis in Rats with Acute Spinal Cord Injury

YANG Liang,Lü De-cheng,ZHENG Lian-jie,et al.Department of Orthopaedics,Second Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116027,Liaoning,China

ObjectiveTo compare the effects of different doses of FTY720 on inhibiting expression of Caspase-3 and neural apoptosis in rats with acute spinal cord injury(SCI),and find out the suitable dose.Methods200 female SD rats were randomly divided into 5 groups with 40 in each group.Group A(laminectomy but not contusion)were administered 0.3 ml normal saline by gavage.SCI model was established by Allen's WD method at the T9level of spinal cord in other groups.Group B were administered 0.3 ml normal saline after modeling.Groups C,D and E were administered 0.3 ml FTY720-saline solution of 1,3 and 5 mg/kg respectively.All the groups were sacrificed at 6 h,12 h,24 h,48 h,72 h(n=8,per each time-point).Caspase-3 expression was detected with streptavidin-peroxidase immunohistochemistry,and neural apoptosis was detected with the TUNEL method.ResultsPositive Caspase-3 expression and neural apoptosis were not observed in Group A at 6 h.In Groups B、C、D and E,the number of apoptotic cells increased with increased time of acute SCI,peaked at 24 h after injury,and then gradually reduced.Caspase-3 expression was at equal pace with neural apoptosis.The difference of the number of apoptotic and Caspase-3 expression cells among all groups were significant,with the order Group B＞Group C＞Group D＞Group A(P＜0.05).However,there was no significant difference between Group D and Group E(P＞0.05).The number of apoptotic and Caspase-3 expression cells negatively correlated with the dose of FTY720 when the dose was less than 3 mg/kg(P＜0.05),and there was no relationship when the dose was more than 3 mg/kg(P＞0.05).ConclusionFTY720 significantly reduces Caspase-3 expression and neural apoptosis in rats with acute SCI.There is a dose-effect relationship between the dose of FTY720 and the Caspase-3 expression and neural apoptosis.It's indicated that 3 mg/kg is the most appropriate dosage.

FTY720;Caspase-3;apoptosis;spinal cord injury;neural regeneration;dose;dose-effect relationship

[本文著錄格式]楊梁，呂德成，鄭連杰，等.不同劑量FTY720對大鼠急性脊髓損傷后Caspase-3表達及細胞凋亡的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2012,18(6):530-534.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.010

遼寧省教育廳資助課題(編號：L2010105)。

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院骨科，遼寧大連市116027；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬一院骨科，遼寧大連市116011；3.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連市116021。作者簡介：楊梁(1973-)，男，山東文登市人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要研究方向：脊柱外科。

R651.2

A

1006-9771(2012)06-0530-05

2012-02-14)

·臨床研究·