鄭春蘇 鄒 燕 黃湘寧 黃清松

腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)是檢測(cè)腎功能最直接指標(biāo)，常用肌酐清除率(Ccr)來評(píng)價(jià)[1]。由于其測(cè)量方法復(fù)雜，臨床上常用血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)來間接反映腎功能[2]，這兩個(gè)指標(biāo)容易受年齡、性別、體重、飲食攝入等因素的影響，并且其評(píng)價(jià)腎功能不全的敏感度較低，有報(bào)道當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降超過50%時(shí)才能導(dǎo)致血Cr輕微上升[3]。胱抑素C(Cystatin C，Cys-C)是一種小分子蛋白[4]，又稱半胱氨酸蛋白酶抑制劑C[5]，由體內(nèi)有核細(xì)胞產(chǎn)生，速率較穩(wěn)定，不受個(gè)體、肌肉量、性別、年齡、腎前因素和慢性炎癥的影響[6]。近年來文獻(xiàn)報(bào)道，循環(huán)血液中的Cys-C幾乎僅經(jīng)腎小球過濾而被清除，其血液中的濃度能夠較準(zhǔn)確地反映GFR[7]，它可以自由通過腎小球?yàn)V過，并且腎小管不分泌排泄,幾乎全部在腎小管重吸收后被分解代謝[8]；血清Cys-C比Cr和Ccr對(duì)反映GFR的變化具有更高的敏感性和特異性，能夠替代Cr和Ccr而作為GFR變化的理想的內(nèi)源性標(biāo)志物指標(biāo)[9-13]。

由于血清中Cys-C濃度較低，故其測(cè)定方法需較高的分析靈敏度及特異性。Cys-C的測(cè)定方法很多，如最早由Lofberg使用的單向免疫擴(kuò)散法(RID)和酶免疫測(cè)定法(EIA)，以及后來的放射免疫法(RIA)和熒光免疫法(FIA)[14]。前兩種方法不僅費(fèi)時(shí)，檢測(cè)限也較差；后兩種方法簡(jiǎn)單、靈敏，但需要特定儀器，儀器價(jià)格昂貴，并且測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，無法滿足常規(guī)、快速檢測(cè)要求。同時(shí)，RIA還對(duì)環(huán)境有污染，對(duì)操作人員有傷害。以上各種測(cè)定方法均屬非均相測(cè)定方法，很難自動(dòng)化，因此，限制了Cys-C廣泛的臨床應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多公司能夠生產(chǎn)膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(PETIA)Cys-C測(cè)定試劑盒。由于這種方法是一種均相測(cè)定方法，不需要特殊的儀器,在普通的生化分析儀上就能檢測(cè)[15]，自動(dòng)化程度高，耗時(shí)少、操作簡(jiǎn)便，所以成為理想的臨床常規(guī)檢測(cè)方法。

建立一個(gè)新的分析方法，或引進(jìn)新的方法、試劑和儀器，都應(yīng)對(duì)它們的技術(shù)性能如精密度、方法比較、線性范圍以及干擾等作出評(píng)價(jià)[16-17]。美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)制定了一套評(píng)價(jià)方案(EP5-A、EP9-A、EP6-A和EP7-A文件)能客觀而正確地對(duì)上述技術(shù)性能作出評(píng)價(jià)。

本臨床實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備使用現(xiàn)成的HITACHI 7100全自動(dòng)生化分析儀將膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法引進(jìn)到Cys-C的日常檢測(cè)工作中，在常規(guī)應(yīng)用之前對(duì)其技術(shù)性能在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了嚴(yán)格的評(píng)價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

(1)HITACHI 7100全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；Sysmex KX-21全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本東亞公司)。

(2)膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法試劑、校準(zhǔn)品和室內(nèi)質(zhì)控品,由浙江省金華市強(qiáng)盛生物科技有限公司提供。

1.1.2 標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源于本院門診或住院患者、體檢者。①血紅蛋白液(100 g/L)；②收集體檢者的用EDTA抗凝的新鮮全血標(biāo)本，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞5次，離心去除上清液，加入適量蒸餾水溶解紅細(xì)胞，測(cè)定血紅蛋白濃度，選取100 g/L備用。

1.2 方法

1.2.1 膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法的檢測(cè)原理

血清中的Cys-C與試劑中的抗人Cys-C抗體膠乳顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)，使反應(yīng)溶液濁度增加。其濁度的增加值與血清中Cys-C的濃度呈正比，在波長(zhǎng)546 nm處檢測(cè)吸光度的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，可計(jì)算出Cys-C的濃度。

1.2.2 主要分析參數(shù)

樣本體積4.0 μl；R1體積120 μl；R2體積30 μl；主波長(zhǎng)546 nm；副波長(zhǎng)800 nm；兩點(diǎn)終點(diǎn)法；反應(yīng)方向?yàn)橄蛏?；反?yīng)溫度為37 ℃；第16個(gè)讀光點(diǎn)讀取A1；第34個(gè)讀光點(diǎn)讀取A2；待測(cè)標(biāo)本吸光度A=A2-A1。

1.2.3 操作方法

先定期請(qǐng)廠家進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，檢測(cè)參數(shù)和程序均按照膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法試劑盒與儀器說明書進(jìn)行設(shè)置，然后用試劑相配套的校準(zhǔn)品進(jìn)行項(xiàng)目定標(biāo)，每天檢測(cè)高、中值室內(nèi)質(zhì)控品，共20 d,計(jì)算均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，確認(rèn)本儀器本項(xiàng)目的質(zhì)控允許范圍。檢測(cè)高、中值室內(nèi)質(zhì)控品，確認(rèn)在控后進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍和干擾因素4項(xiàng)評(píng)價(jià)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度回收試驗(yàn)

參考第3版全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[16]。制備2份不同Cys-C濃度的患者混合血清作為基線標(biāo)本，向每一份1.8 ml的混合基線標(biāo)本中分別加入0 μl、100 μl、200 μl Cys-C高值校準(zhǔn)品(8.90 mg/L)，再分別加入200 μl、100 μl、0 μl生理鹽水。將上述6份體積均為2.0 ml的標(biāo)本，用(膠乳增強(qiáng))免疫透射比濁法進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè)并計(jì)算平均值。通過測(cè)量值減去各自基線值確定回收量，回收率為回收量除以加入量乘以100獲得。計(jì)算4個(gè)回收率的平均值為97.1%。

2.2 精密度試驗(yàn)

參考NCCLS評(píng)價(jià)方案(EP5-A文件)[17]。選擇2例患者混合血清標(biāo)本(正常值1例,高值1例)，每天測(cè)定2次(2次測(cè)定間隔2 h以上),每次測(cè)定均做雙份，連續(xù)測(cè)定20 d,所有雙份數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn)，精密度結(jié)果見表1。

表1 膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測(cè)定血清Cys-C的精密度結(jié)果(n=20)

2.3 線性試驗(yàn)

參考NCCLS評(píng)價(jià)方案(EP6-A文件)[18]。取Cys-C最低值(0.00 mg/L)校準(zhǔn)品為低值標(biāo)本1號(hào),取最高值(8.90 mg/L)校準(zhǔn)品為高值標(biāo)本5號(hào)，低高值3∶1混勻?yàn)?號(hào)，等量混勻?yàn)?號(hào)，1∶3混勻?yàn)?號(hào)，5個(gè)標(biāo)本均測(cè)定4次；取其均值為測(cè)得值(Y)與設(shè)定的理論值(X)的直線回歸方程和相關(guān)系數(shù)如下：Y=1.0241X-0.0502，r=0.9996，本試驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)均未發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn), 稀釋變異為可接受(P=0.55，界限值P0.05=0.6841；現(xiàn)P＜P0.05)，線性失控檢查結(jié)果說明線性良好(F=2.93，界限值F0.05=3.29；現(xiàn)F＜F0.05)。上述結(jié)果表明：Cys-C線性范圍為0.00～8.90 mg/L。

2.4 干擾試驗(yàn)

參考NCCLS評(píng)價(jià)方案(EP7-A文件)[18]。采用“配對(duì)差異”試驗(yàn)方法，將新鮮無溶血、無黃疸、無脂濁的混合血清分成2份，其中一份加入1/10體積的100 g/L血紅蛋白液、8840 umol/L膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液或1/2體積的含甘油三酯18 mmol/L的脂肪乳作為測(cè)定(高值)標(biāo)本5號(hào)；另一份則加入同等體積的生理鹽水作為對(duì)照(低值)標(biāo)本1號(hào)，低高值3∶1混勻?yàn)?號(hào)，等量混勻?yàn)?號(hào)，1∶3混勻?yàn)?號(hào)，4～5號(hào)標(biāo)本分別重復(fù)測(cè)定4次, 1號(hào)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算1～5號(hào)標(biāo)本平均值和1號(hào)標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)差(s)，干擾值(2～5號(hào))＝2～5號(hào)平均值－1號(hào)平均值，干擾值大小在1號(hào)對(duì)照標(biāo)本95%可信限(±1.96 s)范圍內(nèi)判斷為無顯著性干擾,否則為有顯著性干擾。

試驗(yàn)結(jié)果表明：血紅蛋白(負(fù)干擾)濃度水平≤5 g/L、膽紅素(正干擾)濃度水平≤442 umol/L和三酰甘油(負(fù)干擾)≤9 mmol/L時(shí)對(duì)Cys-C測(cè)定均無顯著性干擾。

3 討論

臨床檢驗(yàn)所選用或所引進(jìn)的分析方法，應(yīng)具備兩個(gè)重要的特性：①實(shí)用性：檢測(cè)速度快、標(biāo)本用量少、費(fèi)用低廉和安全可行；②可靠性：方法學(xué)的各項(xiàng)技術(shù)性能指標(biāo)必須達(dá)到要求，這是方法選擇或引用中最重要的原則[19]。為了保證檢驗(yàn)質(zhì)量，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用新的分析方法進(jìn)行患者標(biāo)本檢測(cè)前，必須用實(shí)驗(yàn)去評(píng)價(jià)它的基本性能。NCCLS評(píng)價(jià)方案文件對(duì)于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化具有重要的指導(dǎo)意義[20]。

上述研究結(jié)果顯示，膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測(cè)定血清Cys-C的平均回收率為97.1%，說明準(zhǔn)確度符合要求[19]；批內(nèi)、批間、日間和總變異系數(shù)(CV)符合常規(guī)實(shí)驗(yàn)CV＜5%的要求，說明精密度符合要求；線性范圍較寬(0.00～8.90 mg/L)；干擾因素少。該法采用現(xiàn)成的生化分析儀進(jìn)行檢測(cè),與以前的其他檢測(cè)方法相比,有自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、標(biāo)本用量少、成本低和因人工操作步驟少而引起的誤差大大減少等優(yōu)點(diǎn)，而且本法所用的試劑本身和反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)環(huán)境無污染，對(duì)操作人員無傷害。總之，膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測(cè)定血清Cys-C的首選方法。

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