羅玉玉， 楊 蓉， 孔麟麟， 任黨麗， 張文成△

(1中國人民武裝警察部隊后勤學院生理學與病理生理學教研室，天津300162;2武警沈陽指揮學院門診部，遼寧沈陽110034)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是缺血性心腦血管疾病的重要病理基礎［1］，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢。AS是一種環(huán)境因素與遺傳因素共同作用而誘發(fā)的多基因病，深入研究與AS相關基因的功能及其參與AS發(fā)生的機制是心腦血管疾病研究的熱點領域。

ZNF580是由本課題組以致動脈粥樣硬化因素——低密度脂蛋白(low－density lipoprotein，LDL)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞系，篩選人主動脈cDNA文庫，得到的一個新基因(Gen-Bank注冊號:AF184939)。該基因編碼172個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。經(jīng)分子生物學網(wǎng)站進行蛋白質(zhì)的功能分析顯示:其N端為脯氨酸富含域，C端含有3個串聯(lián)重復的C2H2型鋅指蛋白結構域，可能為C2H2型鋅指核轉錄因子家族的新成員［2－3］。最新的研究表明:C2H2型鋅指核轉錄因子可能是真核細胞轉錄機制最重要的參與者，它們既可以結合DNA，又可以結合蛋白質(zhì)，進而產(chǎn)生廣泛的生物學效應［4－6］。為了尋找可能與ZNF580存在相互作用的蛋白，及其可能參與的細胞內(nèi)信號轉導通路，并最終揭示ZNF580的功能，本研究擬采用酵母雙雜交技術釣取可能與ZNF580存在相互作用的蛋白。

材料和方法

1 菌株和質(zhì)粒

Y190酵母菌購自Clontech;E.coli DH5α菌本室保存;酵母表達載體pGB－Vector購自上海睿星基因公司;人胎腦cDNA文庫(載體為pACT2)購自上海睿星基因公司;pEGFPC1－ZNF580本室保存。

2 主要試劑和試劑盒

營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基購自Clontech;5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(5－bromo－4－chloro－3－indolyl β－D－galactoside，X－Gal)購自鼎國生物技術公司;鮭魚精DNA購自Sigma;SfiⅠ限制性內(nèi)切酶購自鼎國生物技術公司;T4 DNA連接酶購自鼎國生物技術公司;高保真Pfu DNA聚合酶購自Promega;質(zhì)粒提取試劑盒(包括小量提取、大量制備2種)購自碧云天生物技術公司;DNA膠回收試劑盒購自Promega;PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Promega。

3 誘餌質(zhì)粒構建

ZNF580擴增:以pEGFP－C1－ZNF580為模版，生工合成的ZNF580特異性引物對進行 PCR擴增(引物:5'－AAAAAGATCTTGCCCGGAGTGCGCCCGTG － 3'，3'－ AAAAAGCTTGTGGAGGCGCACGTGCTG－5')。PCR反應條件:94℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物過柱回收并酶切:反應按試劑盒說明書進行。目的片段回收并與載體連接:反應按試劑盒說明書進行。重組載體鑒定:重組載體轉化細菌感受態(tài)DH5α，涂卡那霉素陽性平板37℃過夜。挑選7個單克隆搖菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用質(zhì)粒作模板PCR擴增，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，選擇其中2個樣品送TaKaRa測序。

4 誘餌蛋白自激活檢測

采用LiAC轉化法將誘餌質(zhì)粒轉化入酵母菌Y190。檢測誘餌蛋白對LacZ報告基因是否存在轉錄激活作用。轉化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌如果表達β－半乳糖苷酶，則可使底物X－Gal變藍，說明存在自激活，否則說明無自激活。

5 酵母雙雜交篩選人胎腦文庫

5.1 人胎腦cDNA文庫轉化誘餌酵母菌 轉庫效率計算:轉庫效率只有達到1×107～1×108cfu/g DNA以上才能進行文庫的篩選，以保證不會丟失陽性克隆。對生長在SD/－Trp/－Leu平板上的克隆計數(shù)，挑選克隆數(shù)在30～300之間的平板，根據(jù)稀釋度計算轉庫效率。

5.2 營養(yǎng)缺陷平板初步篩選 人胎腦cDNA文庫轉化誘餌酵母菌，轉化方法同上(LiAC轉化法)。取200 μL菌液，涂布于150 mm SD/－Trp/－Leu/－His/+30 mmol/L 3－氨基 －1，2，4－三唑(3－amino－1，2，4－triazole，3－AT)平板上。第3 d起注意觀察平板酵母克隆生長狀態(tài)。菌在SD/－Trp/－Leu/－His+30 mmol/L 3－AT平板上生長7～14 d后，會有陽性克隆長出，陽性克隆一般大于3 mm。

5.3 β－半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗進一步篩選 上述克隆全部進行β－半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗，變藍色的為陽性克隆。

5.4 一對一驗證 隨機挑取部分陽性克隆，抽提質(zhì)粒，一對一轉化誘餌酵母菌驗證，陽性者抽提質(zhì)粒送TaKaRa測序。

6 生物信息學分析

利用 NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb i.nlm.nih.gov)對返回的序列進行BLAST比對分析。

結 果

1 成功構建誘餌質(zhì)粒

成功將ZNF580全長編碼序列構建到酵母表達載體pGB上，見圖1～4，說明pGB－ZNF580構建成功。

2 誘餌蛋白自激活檢測

轉化了誘餌質(zhì)粒的酵母菌落未變藍，轉化了陽性對照質(zhì)粒的酵母菌落變藍，說明誘餌蛋白無自激活?？梢赃M行下一步的篩庫工作，見圖5。

Figure 1.ZNF580 PCR product electrophoresis.圖1 ZNF580 PCR產(chǎn)物電泳

Figure 2.ZNF580 PCR product electrophoresis after restriction enzyme digestion.圖2 ZNF580 PCR產(chǎn)物酶切后電泳

Figure 3.The recombinant plasmid pGB－ZNF580 verified by PCR.M:marker;Lane1～7:PCR products.圖3 重組質(zhì)粒pGB－ZNF580 PCR鑒定

Figure 4.The recombinant plasmid pGB－ZNF580 verified by restriction enzyme digestion.Lane 1 and 2:digestion products.圖4 重組質(zhì)粒pGB－ZNF580酶切鑒定

Figure 5.Bait protein self－autoactivation assay.Left:the colonies of Y190 transformed with pCL1(positive control)turned blue after 2 h，which means the activation of lacZ reporter.Right:the colonies of Y190 transformed with pGB－ZNF580 didn't turn blue，which means the bait proteins had no self－autoactivation and could be used in library screening.圖5 誘餌蛋白自激活檢測

Figure 6.Thirty－five positive colonies identified by β －galactosidase colony－lift filter assay in yeast two－h(huán)ybrid screening.圖6 35個陽性克隆

3 人胎腦cDNA文庫篩選

首先在營養(yǎng)缺陷平板上初步篩選，共獲得169個陽性克隆，此時的1個酵母克隆可能含有2種或2種以上的文庫質(zhì)粒，把全部169個克隆分別在－Trp－Leu平板上劃線分離單克隆后，再挑取單克隆在－Trp－Leu－His平板上培養(yǎng)，把培養(yǎng)板上的克隆全部進行β－半乳糖苷酶克隆轉移濾紙實驗進一步篩選獲得136個陽性克隆。隨機挑選其中40個陽性克隆從酵母中提取質(zhì)粒，再把得到的質(zhì)粒轉入大腸桿菌DH5α中再次用氨芐西林抗性篩選，從中再次提取質(zhì)粒，這樣我們就獲得了文庫質(zhì)粒，把獲得的文庫質(zhì)粒一對一單獨轉入誘餌酵母細胞中，進行重復鑒定。只有轉化了分離所得文庫質(zhì)粒后變藍，轉化了空載體后不變藍的確認為最后的陽性克隆，最終獲得35個陽性克隆，見圖6，提取質(zhì)粒，進行測序分析。

4 生物信息學分析

對35個陽性克隆相應的AD質(zhì)粒進行測序，其中1個沒有測出信號。對其余34個序列進行生物信息學分析，這些序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中是14種不同的基因。編碼14種已知蛋白。其中有2種基因含有完整的編碼序列，分別為SH3－domain GRB2－like 3(SH3GL3)和 D4，zinc and double PHD fingers family 1(DPF1);有12種基因含有部分編碼區(qū)，分別為:activity－dependent neuroprotective protein(ADNP)、Smad family member 2(SMAD2)、glyoxalase domain containing 4(GLOD4)、kinesin family member 3A(KIF3A)、kinesin － associated protein 3(KIFAP3)、phospholipase A2－ activating protein(PLAA)、phospholipase C gamma 1(PLCG1)、XPA binding protein 2(XAB2)、tripartite motif－ containing 32(TRIM32)、suppressor of Ty16 homolog(SUPT16H)、Wilms tumor 1 interacting protein(WTIP)和 DIP2 disco－interacting protein 2 homolog C(DIP2C)。在這些序列中有部分重復，為同一個基因的相同或不同片段。

討 論

本研究應用酵母雙雜交技術篩選人胎腦cDNA文庫，最終獲得了14種可能與ZNF580存在相互作用的蛋白，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫及相關文獻獲得了它們的功能信息。這里我們重點討論ZNF580與其中一種蛋白——磷脂酶C的相互作用關系。

磷脂酶C(phospholipase C，PLC)是普遍存在于哺乳動物細胞中的磷脂酰肌醇信號通路的關鍵酶。目前在哺乳動物中已鑒定出12種PLC同工酶，根據(jù)其不同的氨基酸序列分為5型:PLC－β、PLC－γ、PLC－δ、PLC－ε和 PLC－ξ。許多細胞外信號分子，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫球蛋白、細胞因子、生長因子等都可以激活磷脂酰肌醇特異性PLC。進而將信息傳遞給下游效應分子，調(diào)節(jié)細胞的生命活動［7］。研究發(fā)現(xiàn)，PLC－γ1不僅具有催化分解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的脂酶功能，而且也具有蛋白接合器的作用，PLC－γ1分子除了由X和Y區(qū)構成的酶活性部位外，還有作為蛋白質(zhì)相互結合的SH(Src homology domain)區(qū)，為2個SH2結構域和1個SH3結構域。通過這些結構區(qū)域與其它信號轉導分子結合，產(chǎn)生多種細胞反應［8－9］。目前已知的可以和 PLC－γ1相互作用的蛋白有 Rac1、PLD2、Grb2、Akt等［10－12］。

PLC－γ1是許多能自身磷酸化的生長因子受體作用的底物。如血小板生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素生長因子等［13］。PLC－γ1的活化主要通過蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)途徑。多種生長因子與具有內(nèi)源性PTK活性的受體型PTK結合后，受體發(fā)生二聚化，導致受體內(nèi)在的PTK激活，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化，產(chǎn)生對PLC－γ1具有高親和力的結合位點，活化的PTK能特異性地識別PLC－γ1的SH2結構域，并將蛋白質(zhì)序列中的酪氨酸磷酸化，從而激活PLC－γ1。激活的PLC－γ1水解PIP2產(chǎn)生二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，DAG能激活蛋白激酶C，IP3能引起細胞內(nèi)鈣庫的釋放，通過這兩條通路或者和其它未知通路形成廣泛的crosstalk，從而啟動多種細胞反應，影響著細胞的生長、分化、增殖、凋亡等功能［14］。

本課題組前期對ZNF580蛋白分子進行生物信息學分析表明:ZNF580蛋白分子上存在一系列的蛋白酶磷酸化作用位點，其中141～143位THR氨基酸為蛋白激酶C磷酸化作用位點;130～133位KRSS氨基酸為cAMP及cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化作用位點。可以推測，ZNF580在細胞內(nèi)作為核轉錄因子的活性受磷酸化作用的調(diào)節(jié)。如果ZNF580與PLC－γ1之間存在相互作用，那么ZNF580很可能參與PTK途徑的信號轉導，其可能的信號通路見圖7。

Figure 7.The possible mechanism of ZNF580 involved in protein tyrosine kinase(PTK)signal pathway.PLC:phospholipase C;PIP2:phosphatidylinositol biphosphate;IP3:inositol triphosphate;DAG:diacylglycerol;PKC:protein kinase C.圖7 ZNF580參與PTK信號通路的可能機制

但是關于ZNF580參與的信號轉導途徑及其功能的研究目前仍然處于起步階段，而且由于蛋白質(zhì)分子間的相互作用非常復雜，時空特異性等方面的偏差會導致一些人為的假象。酵母細胞是最簡單的真核細胞，其體內(nèi)蛋白質(zhì)合成后加工修飾類型及其程度與哺乳動物的相應過程存在一定差別，因此酵母雙雜交的結果僅僅是初步提出相互作用的可能性，還需要進一步的實驗證實。

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