王海華， 閔志雪， 戚仁斌， 張根葆， 包鵬舉1，， 胡錢國1，， 孫 瑤

(皖南醫(yī)學(xué)院1生理教研室，2蛇毒研究所，安徽蕪湖241002;3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣東 廣州510632)

膿毒癥是臨床上嚴(yán)重?zé)齻?、休克及手術(shù)后患者重要并發(fā)癥之一，膿毒癥休克是重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)患者死亡的主要原因，病死率高達(dá)30%～45%，嚴(yán)重的低血壓和血管麻痹導(dǎo)致一個或多個器官功能障礙［1－2］。研究表明，一氧化氮(nitric oxide，NO)的過量生成是導(dǎo)致敗血癥休克全身不可逆性低血壓的主要原因［3－4］。內(nèi)源性一氧化氮主要是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化L－精氨酸生成的。給實(shí)驗(yàn)動物注射純化的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)來模擬敗血癥休克是近年來國際上比較通用的有效手段［5－6］，LPS進(jìn)入體內(nèi)能刺激多種組織因子及血管活性物質(zhì)過量表達(dá)，從而導(dǎo)致心血管功能障礙，但LPS引起的心血管功能障礙的機(jī)制至今尚未完全闡明。

臨床發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗生素對內(nèi)毒素引起的炎癥無作用，多黏菌素B(polymyxin B，PMX－B)作為脂多糖的抑制劑，具有顯著抗內(nèi)毒素作用［7］。本研究通過腹腔注射純化的LPS誘導(dǎo)大鼠內(nèi)毒素血癥模型，探討LPS引發(fā)的內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性與誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)－鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)－環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)信號活化的相關(guān)性，同時闡明PMXB在內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性的可能作用機(jī)制。

材料和方法

1 藥品和試劑

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、氨基胍(aminoguanidine，AMG)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)和亞甲藍(lán)(methylene blue，MB)均購自Sigma。去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe)由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)。TNF－α、NO和iNOS檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 內(nèi)毒素血癥大鼠模型復(fù)制

健康SD雄性大鼠(浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供)24只，動物質(zhì)量合格證SCXK(浙)20080033，體重(220±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，LPS(10 mg/kg，ip)建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型，腹腔注射LPS 2 h后，動物即表現(xiàn)出盤索成團(tuán)、萎靡不振、腹瀉、活動度低下并伴有發(fā)紺、震顫等癥狀;4 h后血壓明顯下降，但動物沒有死亡，說明內(nèi)毒素血癥模型復(fù)制成功。

3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分為4組:LPS組，LPS(10 mg/kg，ip，4 h);LPS+PMX －B 組(LPS+PMX －B 組)，LPS(10 mg/kg，ip，3.5 h)后從尾靜脈注射PMX－B(0.2 mg/kg)，余同 LPS組;PMX －B 組，腹腔注射生理鹽水3.5 h后從尾靜脈注射PMX－B(0.2 mg/kg)，余同LPS組;sham組，同時點(diǎn)均注射生理鹽水。1 h后進(jìn)行大鼠血壓測定。

3.2 大鼠血壓測定 20%烏拉坦(5 mL·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠后，取仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺，行頸總動脈插管術(shù)，通過壓力傳感器連接MedLab系統(tǒng)記錄平均動脈血壓(mean arterial blood pressure，MABP)，監(jiān)測時先穩(wěn)定20 min，再觀測30 min。然后頸總動脈采血2 mL，低溫超速離心后取上清液－20℃保存，留作后續(xù)生化指標(biāo)檢測。

3.3 離體主動脈血管環(huán)標(biāo)本的制備 采血后，迅速打開大鼠胸腔，取出胸腹段主動脈，置于4℃氧飽和的Krebs液中，清除血塊和血管周圍結(jié)締組織，Krebs液的成分為(mmol·L－1):NaCl 118.4，KCl 4.7，KH2PO41.18，MgSO4·7H2O 1.1，NaHCO34.5，CaCl22.25，glucose 11.1，pH 7.2 ～7.4。將血管均勻剪成約3 mm長的血管環(huán)，套入上下平行的2個不銹鋼鉤，通過張力換能器連接MedLab系統(tǒng)記錄張力變化。整個動脈環(huán)置入盛有10 mL Krebs液的37℃恒溫浴槽內(nèi)，持續(xù)通以95%O2+5%CO2混和氣。先以0 g張力起步，平衡30 min后，逐步調(diào)節(jié)至最適初始張力1.5 g并平衡1 h，每15 min換液1次。以KCl 60 mmol·L－1收縮動脈環(huán)3次，直至收縮穩(wěn)定，以激發(fā)主動脈血管環(huán)最佳活性，當(dāng)主動脈血管環(huán)對連續(xù)2次同樣的KCl刺激所引起的收縮幅度差別＜10%時，開始正式實(shí)驗(yàn)。

3.4 主動脈血管環(huán)收縮與舒張功能的測定 采用累積給藥法，觀察間隔5 min累積給予1×10－8～1×10－5mol·L－1Phe誘導(dǎo)的主動脈血管環(huán)的收縮反應(yīng)和1×10－8～1×10－4mol·L－1ACh誘導(dǎo)的主動脈血管環(huán)的舒張反應(yīng);分別用特異性iNOS抑制劑AMG(1×10－4mol·L－1)及 GC 抑制劑 MB(1 ×10－5mol·L－1)預(yù)處理主動脈血管環(huán)20 min后，觀察間隔5 min累積給予濃度為1 ×10－8～1 ×10－5mol·L－1Phe誘導(dǎo)的主動脈血管環(huán)的收縮反應(yīng)。記錄主動脈血管環(huán)收縮幅度，并計算血管收縮率(vascular contraction rate，VCR)。血管收縮率(%)=(累加 Phe后的主動脈血管環(huán)收縮張力－最適初始張力)/空白組最大收縮張力平均值×100%。血管舒張率(%)=(加Phe后的主動脈血管環(huán)收縮張力－累加ACh后的血管張力)/(加Phe后的血管最大收縮張力－基礎(chǔ)血管張力)×100%。以上每一輪實(shí)驗(yàn)完成后用K－H液反復(fù)沖洗3～5次，直至主動脈血管環(huán)張力恢復(fù)到實(shí)驗(yàn)前的基礎(chǔ)水平才可以開始下一輪實(shí)驗(yàn)。

3.5 生化指標(biāo)檢測 使用UV－3200PCS紫外分光光度計檢測血漿中NO和iNOS;使用Model－680型酶標(biāo)儀測定血清中TNF－α水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠MABP變化

如圖1所示，同sham組相比，LPS組大鼠MABP顯著降低(P＜0.01)，PMX－B組大鼠MABP無明顯改變(P＞0.05);而LPS+PMX－B組大鼠MABP與LPS組相比顯著改善(P＜0.05)。

Figure 1.Changes of mean arterial blood pressure(MABP)in rats from different groups.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS group.圖1 各組大鼠平均動脈血壓的改變

2 離體主動脈血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 主動脈血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)和對ACh刺激的舒張反應(yīng) 如圖2、3所示，同sham組相比，LPS組大鼠離體主動脈血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)以及對ACh刺激的舒張反應(yīng)均顯著降低(P＜0.01)，而PMX－B組無明顯變化(P＞0.05);同LPS組相比，LPS+PMX－B組大鼠離體主動脈血管環(huán)對Phe引起的收縮反應(yīng)和ACh引起的最大舒張反應(yīng)均顯著改善，只是部分恢復(fù)，仍低于 sham組(P＜0.05)。

Figure 2.Effects of phenylephrine on tension of the aorta rings of rats.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS group.圖2 各組大鼠主動脈血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)

Figure 3.Effects of acetylcholine on relaxation of the aorta rings of rats.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs LPS group.圖3 各組大鼠主動脈血管環(huán)對ACh刺激的舒張反應(yīng)

2.2 用AMG(1×10－4mol·L－1)預(yù)處理后主動脈血管環(huán)對Phe刺激后張力的變化 表1顯示:通過AMG(1×10－4mol·L－1)預(yù)處理后相比較，各組主動脈血管環(huán)對1×10－7～1×10－5mol·L－1Phe誘導(dǎo)的收縮幅度均有升高;尤其在AMG預(yù)處理20 min前后LPS組大鼠主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L Phe引起的最大收縮幅度的差值 (54.17% ±7.92%)，明顯高于sham組和LPS+PMX－B組(P＜0.01);LPS+PMX－B組大鼠預(yù)處理前后差值與LPS組相比則明顯降低(P＜0.01);PMX－B組與sham組相 比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.01)。

表1 主動脈血管環(huán)經(jīng)AMG預(yù)處理前后對Phe刺激的收縮反應(yīng)Table 1.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with AMG(1 ×10－4 mol·L－1)(%.±s.n=6)

表1 主動脈血管環(huán)經(jīng)AMG預(yù)處理前后對Phe刺激的收縮反應(yīng)Table 1.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with AMG(1 ×10－4 mol·L－1)(%.±s.n=6)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham;△△P ＜0.01 vs LPS;pP ＜0.05，ppP ＜0.01 vs LPS+PMX －B;●P ＜0.05，●●P ＜0.01 vs PMX －B;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs sham+AMG;○P ＜0.05，○○P ＜0.01 vs LPS+AMG.

Phe(mol·L－1)10 －8 10－7 10 －6 10－5 Sham 14.74 ±3.79 67.21 ±16.39 91.26 ±13.38 101 Group.97 ±7.38 Sham+AMG 26.70 ±8.44* 82.36 ±23.84* 107.09 ±13.31＊＊ 123.75 ±19.34*LPS 5.99 ±2.59 21.38 ±8.20 35.81 ±8.26 39.19 ±9.05 LPS+AMG 17.15 ±8.41△△ 42.65 ±14.98△△## 68.43 ±13.37△△## 93.36 ±9.89△△##LPS+PMX － B 9.32 ±2.34 37.29 ±9.11 60.78 ±8.25 78.08 ±11.39 LPS+PMX － B+AMG 21.22 ±7.54p 65.83 ±14.69pp○ 87.65 ±13.37pp#○ 105.52 ±10.31pp#PMX － B 13.52 ±2.69 49.73 ±8.56 89.69 ±6.73 102.19 ±13.40 PMX －B+AMG 22.43 ±9.10● 75.97 ±19.31●○○ 105.09 ±19.70●○○ 121.88 ±13.20●●○○

2.3 用 MB(1 ×10－5mol·L－1)預(yù)處理后主動脈血管環(huán)對Phe刺激后張力的變化 表2顯示:通過MB(1 ×10－5mol·L－1)預(yù)處理 20 min 后相比較，各組主動脈血管環(huán)對 1×10－7～1×10－5mol·L－1Phe誘導(dǎo)的收縮幅度均有升高;從MB預(yù)處理前后比較，LPS+PMX－B組主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L Phe引起的最大收縮幅度的差值與sham組無顯著差異，均明顯低于LPS組(P＜0.01);PMX－B組與sham組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 主動脈血管環(huán)經(jīng)MB預(yù)處理前后對Phe刺激的收縮反應(yīng)Table 2.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with MB(1 ×10－5mol·L－1)(%.±s.n=6)

表2 主動脈血管環(huán)經(jīng)MB預(yù)處理前后對Phe刺激的收縮反應(yīng)Table 2.Effects of phenylephrine(10－8～10－5mol·L－1)on tension of the aorta rings of rat after pretreatment with MB(1 ×10－5mol·L－1)(%.±s.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs sham;△△P ＜0.01 vs LPS;ppP ＜0.01 vs LPS+PMX －B;●P ＜0.05，●●P ＜0.01 vs PMX －B;#P ＜0.05.##P ＜0.01 vs sham+MB;○P ＜0.05，○○P ＜0.01 vs LPS+MB.

Phe(mol·L－1)10 －8 10－7 10 －6 10－5 Sham 14.74 ±3.79 67.21 ±16.39 91.26 ±13.38 101 Group.97 ±7.38 Sham+MB 50.28 ±4.85＊＊ 103.16 ±12.62＊＊ 120.29 ±8.55＊＊ 140.17 ±7.61＊＊LPS 5.99 ±2.59 21.38 ±8.20 35.81 ±8.26 39.19 ±9.05 LPS+MB 45.04 ±9.45△△ 79.63 ±8.91△△## 97.36 ±10.09△△## 110.05 ±9.89△△##LPS+PMX － B 9.32 ±2.34 37.29 ±9.11 60.78 ±8.25 78.08 ±11.39 LPS+PMX － B+MB 51.70 ±5.42pp 92.61 ±10.93pp 110.89 ±13.31pp 129.02 ±17.09pp○○PMX － B 13.52 ±2.69 49.73 ±8.56 89.69 ±6.73 102.19 ±13.40 PMX －B+MB 55.80 ±8.06●●○ 81.30 ±17.64●# 106.15 ±16.10 134.29 ±16.47●●○○

3 生化指標(biāo)檢測

表3顯示，LPS組大鼠血漿中iNOS濃度、NO含量及TNF－α水平較sham組明顯增高(P＜0.01);LPS+PMX－B組較LPS組降低明顯(P＜0.01);而PMX－B組與sham組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

討 論

敗血癥休克的主要特征之一是全身不可逆性低血壓。給實(shí)驗(yàn)動物注射純化的LPS來模擬敗血癥休克是近年來國際上比較通用的有效手段［5－6］，LPS進(jìn)入體內(nèi)能刺激多種組織因子及血管活性物質(zhì)過量表達(dá)，從而導(dǎo)致心血管功能障礙，表現(xiàn)為體循環(huán)血管舒張和對血管收縮劑反應(yīng)性降低。NO的過量生成是導(dǎo)致敗血癥休克全身不可逆性低血壓的主要原因［3－4］。內(nèi)源性NO主要是由一氧化氮合酶(NOS)催化L－精氨酸生成的。NO在敗血癥休克中起“雙刃劍”作用，適量的NO可引起血管舒張，降低血流阻力，抑制血小板聚集，防止小血管栓塞，增加心、腦等重要臟器的血流量，對機(jī)體有保護(hù)意義;但是NO過量產(chǎn)生會導(dǎo)致血管過度擴(kuò)張，血管平滑肌對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性降低，造成全身不可逆性低血壓和循環(huán)衰竭。NO進(jìn)入細(xì)胞后激活可溶性GC，使GTP轉(zhuǎn)變?yōu)閏GMP，激活蛋白激酶 G的活性增加［8］，而cGMP依賴性蛋白激酶使鈣內(nèi)流減少，增加肌漿網(wǎng)鈣ATP酶對鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化，從而產(chǎn)生舒血管作用［9］。NO是自由基，當(dāng)形成OONO－時具有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用［10］。

表3 大鼠血漿中NO、iNOS和TNF－α水平的變化Table 3.Changes of the plasma levels of NO，iNOS and TNF－α in rats of each group(±s.n=6)

表3 大鼠血漿中NO、iNOS和TNF－α水平的變化Table 3.Changes of the plasma levels of NO，iNOS and TNF－α in rats of each group(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LPS group.

Group NO(μmol·g－1protein)iNOS(103U·g－1protein)TNF－α(ng·L－1)Sham 4.09 ±0.58 521.90±111.95 304.32±17.40 PMX －B 5.43±1.66## 661.88±210.02## 318.99±21.10##LPS 15.41±3.24＊＊ 1 774.30±331.23＊＊ 450.64±29.98＊＊LPS+PMX －B 6.03±1.39## 783.79±107.13*## 332.74±30.06##

本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射LPS復(fù)制大鼠內(nèi)毒素血癥模型基礎(chǔ)上，整體觀察大鼠血壓及血清中NO、iNOS和TNF－α水平;同時結(jié)合離體血管灌流方法，利用Phe引發(fā)血管收縮的原理，旨在探討LPS誘發(fā)的內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性與iNOS－GC－cGMP信號活化的相關(guān)性，同時闡明PMX－B在內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性的可能作用機(jī)制。

多黏菌素(polymyxin)是發(fā)現(xiàn)于多黏桿菌(Bacillus polymyxa)培養(yǎng)液中的抗菌性多肽，具有表面活性，含有帶陽電荷的游離氨基，能與革蘭陰性菌細(xì)胞膜的磷脂中帶陰電荷的磷酸根結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜面積擴(kuò)大，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的磷酸鹽、核苷酸等成份外漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡［11］。PMX－B具有顯著抗內(nèi)毒素作用［7］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS組大鼠MABP顯著降低，而LPS+PMX－B組大鼠MABP則改善明顯，與文獻(xiàn)報道一致［12］;LPS組大鼠血清中NO、iNOS以及TNF－α水平均顯著高于sham組;TNF－α是內(nèi)毒素進(jìn)入體內(nèi)誘導(dǎo)機(jī)體效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一，它與感染的嚴(yán)重程度以及內(nèi)毒素血癥的預(yù)后密切相關(guān)。離體血管灌流實(shí)驗(yàn)血管環(huán)張力結(jié)果顯示，LPS組血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)量效曲線和對ACh的舒張反應(yīng)量效曲線均顯著低于sham組;而LPS+PMX－B組大鼠血管環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)和ACh的舒張反應(yīng)均明顯恢復(fù)。研究表明，LPS在大鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)組織、細(xì)胞(包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞)產(chǎn)生大量的NO，后者可能通過多種途徑削弱血管平滑肌對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)［4］。

有關(guān)Phe刺激血管環(huán)的收縮機(jī)制，是血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平升高所致，其主要來源于胞內(nèi)鈣池釋放和胞外鈣的跨膜內(nèi)流。胞內(nèi)鈣池主要分為肌醇1，4，5－三磷酸敏感鈣池和ryanodine敏感鈣池，胞外鈣主要通過受體操縱性Ca2+通道(receptor－operated calcium channels，ROCCs)和電壓操縱性Ca2+通道(voltage－operated calcium channels，VOCCs)內(nèi)流。實(shí)驗(yàn)分別用特異性iNOS阻斷劑AMG和GC抑制劑MB預(yù)孵育血管環(huán)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠主動脈血管環(huán)對Phe引起的收縮反應(yīng)與孵育前比較均升高，尤其在AMG預(yù)處理20 min前后LPS組大鼠主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L的Phe引起的最大收縮幅度的差值 (54.17% ±7.92%)，明顯高于sham組和LPS+PMX－B組;這提示iNOS過量表達(dá)產(chǎn)生NO增多為導(dǎo)致血管低反應(yīng)性的主要原因［13］。而GC抑制劑MB預(yù)處理20 min前后，LPS+PMX－B組主動脈血管環(huán)對1×10－5mol/L Phe引起的最大收縮幅度的差值與sham組無顯著差異，均明顯低于LPS組，這也說明PMX－B可能通過抑制iNOS－GC－cGMP信號活化，減少iNOS過量表達(dá)，從而改善內(nèi)毒素血癥大鼠的血管低反應(yīng)性［14］。

綜上所述，iNOS－GC－cGMP信號活化參與了內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性;多黏菌素B可以改善內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性。多黏菌素B對內(nèi)毒素有滅活作用，從而使大鼠血清TNF－α水平降低，改善內(nèi)毒素血癥大鼠血管的低反應(yīng)性，抑制iNOS－GC－cGMP信號活化，減少iNOS過量表達(dá)，減少NO過量生成，從而改善內(nèi)毒素血癥大鼠的血管低反應(yīng)性;至于是否還有其它機(jī)制參與尚需進(jìn)一步的深入研究。

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