秦玉璇， 李東風， 張世能， 段伊帆， 謝子鈞， 李子俊△

(1南方醫(yī)科大學研究生院，廣東廣州510515;廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院2消化科，3醫(yī)學研究中心，廣東廣州510080;4中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化科，廣東廣州510120)

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，具有早期 侵襲性生長和遠處轉移的特性，預后極差，平均5年生存率不到5%。Ras信號通路的異常活化與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。Kirston－ras癌基因蛋白(簡稱K-Ras)是Ras信號通路的核心成員，而RASA1蛋白是負性調節(jié)K-Ras的關鍵蛋白之一。本實驗擬檢測RASA1在胰腺癌及胰腺良性病變組織中的表達水平，分析其與胰腺癌臨床病理特征的關系，探討其在胰腺癌發(fā)病中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞 人胰腺癌細胞株Capan-2、CFPAC-1和BxPC-3(Capan-2和CFPAC-1為K－ras基因突變型，BxPC-3為K－ras基因野生型)購自中國科學院上海細胞研究所，使用RPMI-1640或DMEMHG培養(yǎng)基(Life Technologies)加10%胎牛血清(Life Technologies)，5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng);正常人胰腺導管上皮細胞H6C7(由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院張世能教授惠贈)使用 Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基(Life Technologies)加10%胎牛血清(Life Technologies)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。

1.2 組織切片 取廣東省人民醫(yī)院病理標本庫2000年至2009年胰腺導管腺癌切除石蠟標本32例，所有患者術前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療，術中未發(fā)現(xiàn)遠處轉移。按日本胰腺病學會提出的胰腺癌分類標準:依據(jù)腫瘤組織的大小、浸潤范圍、局部淋巴結轉移及遠處轉移等情況，將胰腺癌分為Ⅰ～Ⅳ期。32例中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期各5、13和14例，無Ⅳ期患者。臨床隨訪時間:自患者術后開始隨訪至2011年9月，共23例達到隨訪終點。另取10例胰腺良性病變(5例胰腺囊腫、5例慢性胰腺炎)組織標本作為對照(來源于廣東省人民醫(yī)院病理標本庫)。所有標本均經(jīng)病理科醫(yī)生復習閱片后制備石蠟組織切片。腫瘤患者臨床資料見表1。

表1 胰腺癌患者臨床特征Table 1.Clinical characteristics of pancreatic cancer patients

2 方法

2.1 熒光定量PCR法檢測細胞中RASA1 mRNA表達 采用Trizol(Life Technologies)提取細胞總RNA。通過逆轉錄獲得cDNA，以GAPDH為內參照，進行熒光定量PCR。RASA1引物:正義鏈5’-TGACAGAACGATAGCAGAAGAAC-3’，反義鏈 5’-TTCCACCAATGTAGTAATC TCCAC-3’;在 ABI-7500型熒光定量PCR儀上進行PCR反應。反應條件:95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，50個循環(huán)。反應結束后確認real-time PCR的擴增曲線和熔解曲線，利用實時熒光PCR儀自帶軟件進行分析，獲得產物Ct值;并回收產物，進行瓊脂糖凝膠電泳。RASA1 mRNA的相對表達量采用2-ΔCt計算。

2.2 Western blotting檢測細胞中RASA1蛋白的表達 以400 μL 100℃ 1×SDS裂解液裂解2×106個細胞，煮沸10 min;4℃、20 000×g離心10 min，取上清;BCA法測定蛋白濃度;調整濃度至1 g/L，取20 μL蛋白行SDS-PAGE電泳;將蛋白質轉印到PVDF膜上;兔抗人RASA1多克隆抗體(Epitomics)1∶1 000稀釋、兔抗人GAPDH單克隆抗體(CST)1∶2 000稀釋，4℃孵育過夜;加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗(CST)1∶1 500稀釋，室溫孵育1 h;ECL(Invitrogen)顯色，曝光。BandScan 5.0軟件分析條帶灰度并進行統(tǒng)計學分析。

2.3 免疫組化檢測組織中RASA1蛋白的表達 采用免疫組化EnVision染色法檢測RASA1蛋白表達。石蠟組織常規(guī)脫蠟水化;pH 8.0 Tris-EDTA液高溫高壓修復;3%H2O2室溫孵育15 min消除內源性過氧化物酶，PBS漂洗;兔抗人RASA1單克隆抗體(Lifespan)1∶50稀釋，室溫孵育60 min，PBS漂洗;羊抗兔EnVision試劑(上?；蚬?室溫孵育35 min，PBS漂洗;DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，樹膠封片。PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，用已知表達陽性的人卵巢癌標本作為陽性對照。陽性細胞必須具備:(1)細胞結構清晰;(2)陽性顆粒定位準確;(3)著色明顯高于背景，對比清楚。RASA1定位于細胞質。陽性染色為黃色、棕黃色或棕褐色。免疫組化結果根據(jù)陽性細胞染色強度判定:無著色為0分，淡黃色或黃色為1分，棕黃色或棕褐色為2分。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析比較各細胞株間RASA1 mRNA表達差異，采用χ2檢驗及Fisher精確概率法分析各組織中RASA1的表達差異及RASA1表達水平與各臨床病理特征之間的關系;對于不符合正態(tài)分布和/或方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 胰腺細胞中RASA1 mRNA表達水平

胰腺癌細胞(BxPC-3、Capan-2、CFPAC-1)和胰腺導管上皮細胞(H6C7)RASA1 mRNA的相對表達量(×10-5)分別為:20.38 ±3.25、35.99 ±4.80、34.15 ±5.61 和 41.20 ±4.88;其中 BxPC-3、Capan-2、CFPAC-1與H6C7的表達量之間差異顯著(均P＜0.01)，即上述胰腺癌細胞中RASA1 mRNA表達量均低于胰腺導管上皮細胞。BxPC-3細胞(K－ras基因野生型)中的RASA1 mRNA表達量顯著低于Capan-2和CFPAC-1細胞(K－ras基因突變型)(P＜0.01);而Capan-2和 CFPAC-1細胞的表達量之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.RASA1 mRNA expression in different pancreatic cells.±s.n=9.*P＜0.05 vs other groups.#P＜0.05 vs Capan-2 or CFPAC-1.H6C7:pancreatic duct cells;Capan-2 and CFPAC-1:K-ras-mutant pancreatic cancer cells;BxPC-3:K-ras-wild pancreatic cancer cells.圖1 胰腺細胞中RASA1 mRNA的表達差異

2 胰腺RASA1蛋白表達水平

2.1 胰腺細胞中RASA1蛋白的表達 胰腺導管上皮細胞的RASA1蛋白表達量高于胰腺癌細胞株;Capan-2和CFPAC-1細胞的蛋白表達量高于BxPC-3細胞，其趨勢與mRNA表達水平相一致，見圖2。

Figure 2.RASA1 protein expression in different pancreatic cells.±s.n=6.*P ＜0.05 vs other groups.#P ＜0.05 vs CFPAC-1.H6C7:pancreatic duct cells;BxPC-3:K －ras-wild pancreatic cancer cells;Capan-2 and CFPAC-1:K －ras-mutant pancreatic cancer cells.圖2 胰腺細胞中RASA1蛋白的表達差異

2.2 胰腺組織中RASA1蛋白的表達 免疫組化結果顯示，胰腺癌組織及胰腺良性病變組織中RASA1均表達于實質細胞細胞漿中，且90%以上細胞可見染色(評分標準見前述方法)，見圖3。胰腺癌組織中，記0分和1分的組織各16例;良性病變組織3例記2分，2例記0分，其余記1分;兩者差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，見表2。

3 胰腺癌組織中RASA1蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

胰腺癌病例組RASA1高表達(染色為淡黃色或黃色，評分為1分)和低表達(無染色，評分為0分)各16例。依據(jù)胰腺癌浸潤程度不同將手術切除病例分為2組，即胰腺癌局部浸潤組(包括胰腺及胰周組織)和胰腺周圍器官浸潤組(十二指腸、膽管、腸系膜等)。其中胰腺局部浸潤組7例，RASA1低表達者1例，高表達6例;胰腺周邊浸潤組25例，RASA1低表達者15例，高表達者10例。2組比較發(fā)現(xiàn)RASA1表達量周圍器官浸潤組顯著低于局部浸潤組(P＜0.05)。依據(jù)日本胰腺癌分期，I期的胰腺癌中100%RASA1高表達(5/5)，而在Ⅱ/Ⅲ期胰腺癌中，RASA1低表達者占59.26%(16/27)，高表達者占40.74%(11/27)。Ⅱ/Ⅲ期胰腺癌與 I期胰腺癌比較，RASA1表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而RASA1在不同性別、淋巴結有無轉移等分組中表達差異無統(tǒng)計學意義;而RASA1高表達組和低表達組間年齡、腫瘤最大直徑、術后生存時間均無顯著差異，見表3。

Figure 3.The immunohistochemistry for RASA1 between different tissues.A1:pancreatic cancer tissue(×200);A2:pancreatic cancer tissue(×400);B1:chronic pancreatitis tissue(×200);B2:chronic pancreatitis tissue(×400);C1:pancreatic cyst tissue(×200);C2:pancreatic cyst tissue(×400).圖3 RASA1免疫組織化學結果

表2 胰腺癌和胰腺良性組織RASA1蛋白的表達差異Table 2.RASA1 protein expression differences between pancreatic cancer tissues and pancreatic benign lesion tissues

討 論

由于環(huán)境污染和人們的飲食結構改變等原因，胰腺癌的發(fā)病率和病死率逐年增高。調查報告顯示，截止2006年上海市區(qū)胰腺癌發(fā)病率達到12.17/10萬，較上世紀70年代發(fā)病率上升約70%［1］。而美國每年有44030例新發(fā)胰腺癌病例，同時有37660例患者死亡［2］。因此，有關胰腺癌的研究已成為目前的熱點和難點，挖掘和發(fā)現(xiàn)敏感而又特異的早診分子標志物是治愈胰腺癌的關鍵。

表3 胰腺癌組織RASA1表達與臨床病理特征的關系Table 3.The relationship between clinicopathological features and RASA1 expression level in the pancreatic tissues

2008年Jones等［3］通過全基因組檢測發(fā)現(xiàn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與12條分子信號通路相關，其中又以ras信號通路與胰腺癌關系最為密切。過去有關Ras通路異?；罨难芯慷嗉性趓as基因突變與腫瘤發(fā)生的關系［4-5］，而有關野生型ras基因與腫瘤發(fā)病關系的研究較少，即野生型ras基因所調控的Ras信號通路和在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚不清楚。近來，有研究顯示在ras基因野生型腫瘤中，同樣存在著Ras蛋白過度活化以及Ras信號通路的調節(jié)異常，與Ras活化的抑制子如 Ras GTP酶活化蛋白(Ras GTPase activating proteins，Ras GAPs)下調或作用缺失有關［6-7］。

通常體內Ras蛋白處在Ras GTP活化和Ras GDP失活兩種循環(huán)狀態(tài)，而調節(jié)它們的是兩類酶蛋白分子，即Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(Ras guanine nucleotide exchange factors，Ras GEFs)和 Ras GAPs。Ras GEFs促使 Ras GDP轉化為活化狀態(tài)的 Ras GTP，開放Ras信號通路，而 Ras GAPs則通過增加Ras蛋白內在的GTPase活性，水解Ras GTP形成Ras GDP，關閉Ras信號通路而發(fā)揮負調控作用。

RASA1是最早發(fā)現(xiàn)的Ras GAPs之一，相對分子量為120 kD，屬胞漿蛋白。其N端由SH3、SH2、PH及CaLB/C2等區(qū)域組成，C端是具有催化作用的GTP酶活化蛋白(GAP)結構域。RASA1通過GAP相關催化域與活化的Ras(Ras GTP)結合，激活內在的Ras GTP酶活性，促進Ras GTP水解為Ras GDP，從而關閉Ras信號通路［8］。

現(xiàn)有的研究表明:RASA1是胞內調節(jié)細胞增殖凋亡信號通路的關鍵分子，其與眾多腫瘤細胞轉化相關［9］。Davidson等［10］發(fā)現(xiàn)在 16% 的前列腺癌組織中胞漿RASA1表達較前列腺良性組織減少，推測可能起到抑癌基因的作用。分別采用基因芯片或比較基因組雜交的方法檢測乳腺癌細胞和組織中基因表達，結果均表明相對于正常組織或細胞，RASA1在乳腺癌組織或細胞中表達明顯下調或缺失，說明RASA1的缺失可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進作用［11-13］。此外，通過蛋白芯片檢測發(fā)現(xiàn)在多株結腸癌、胃癌及乳腺癌等腫瘤細胞中，耐藥細胞株的RASA1表達較非耐藥細胞株顯著下調，提示RASA1的缺失在腫瘤細胞產生耐藥的過程中起作用［14］。

本研究檢測胰腺癌細胞和組織中RASA1的表達，結果發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞和組織中RASA1的表達較正常細胞或良性病變組織中均表達顯著下調，說明RASA1在胰腺癌發(fā)生中可能具有抑癌蛋白樣的作用。臨床研究依據(jù)胰腺癌浸潤程度不同將手術切除標本分為兩組，即胰腺癌局部浸潤組(包括胰腺及胰周組織)和胰腺周圍器官浸潤組(十二指腸、膽管、腸系膜等)，結果發(fā)現(xiàn)后者RASA1表達量顯著低于局部浸潤組，提示RASA1表達量減低可能與腫瘤的侵襲能力提高有關。而關于胰腺癌有無淋巴結轉移的研究發(fā)現(xiàn)，RASA1表達量高低與淋巴結是否轉移相關性不明確。

本研究結果分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期胰腺癌組織中RASA1表達量顯著高于Ⅱ、Ⅲ期組織，說明RASA1的表達降低可能是發(fā)生在胰腺癌早期的分子事件，提早檢測或干涉胰腺癌中RASA1的表達水平有可能對胰腺癌的早診或防治有價值，有待進一步深入研究。

綜上所述，Ras信號通路是參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展中重要的通路之一，而RASA1與Ras通路關閉失活密切相關。本研究首次證實了RASA1在胰腺癌腫瘤和良性組織中表達差異顯著，且發(fā)現(xiàn)其表達與胰腺癌的浸潤深度、分期相關，說明RASA1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。未來有關RASA1及同類RAS GAP蛋白分子功能的深入研究，有望從RAS信號通路活化的另一側面尋找和挖掘到腫瘤診斷或治療新的靶分子。

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