虞紅珍， 祝 敏， 王 豫， 徐勤枝， 周平坤△

(1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，安徽合肥230032;2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

肌球蛋白VI(myosin VI)是其家族中唯一一個(gè)向微絲負(fù)極移動(dòng)的蛋白，能水解ATP酶產(chǎn)生能量推動(dòng)肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng)，是細(xì)胞的馬達(dá)蛋白，能為細(xì)胞的遷移提供動(dòng)力，參與吞飲或吞噬泡的運(yùn)輸，負(fù)責(zé)將高爾基體的分泌泡運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)適當(dāng)?shù)奈恢玫龋?－4］。Yoshida等［5］發(fā)現(xiàn) myosin VI在卵巢癌中異常高表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但在人體其它腫瘤中沒有做進(jìn)一步的探討。本研究通過(guò)cDNA多腫瘤表達(dá)譜陣列芯片技術(shù)篩查myosin VI在19種人體不同腫瘤組織和10種腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況，進(jìn)一步采用組織芯片，利用免疫組化方法檢測(cè)myosin VI在不同病理分級(jí)卵巢上皮腫瘤組織中的表達(dá)情況，以驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而為探討myosin VI在腫瘤中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

Cancer Profiling ArrayⅡ及Express Hyb雜交液為Clontech產(chǎn)品;引物合成與序列測(cè)定由北京英駿生物有限公司完成;Prime－a－Gene標(biāo)記試劑盒為Promega產(chǎn)品;myosin VI單抗購(gòu)自 Sigma;DNA Taq聚合酶為鼎國(guó)生物有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠回收試劑盒為天根生化(北京)公司產(chǎn)品;［α－32P］dCTP購(gòu)自北京福瑞生物有限公司;不同病理級(jí)別人卵巢癌及癌旁正常組織組織芯片及資料由解放軍總醫(yī)院病理科自制提供;免疫組化檢測(cè)試劑(SP法)及二氨基聯(lián)苯胺(3，3＇－diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)公司購(gòu)買。

2 Northern雜交

2.1 探針合成與標(biāo)記 以HeLa細(xì)胞cDNA為模板，以myosin VI mRNA序列隨機(jī)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增myosin VI片段用于Northern雜交。引物序列為:上游引物 5＇－ CGGAGGAGACACAAACCT －3＇，下游引物5＇－GCTATCTCCGCAGCGCCAGGT －3＇。反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán);產(chǎn)物600 bp。將目的PCR產(chǎn)物割膠回收純化，DNA測(cè)序后，按照 Prime－a－Gene標(biāo)記試劑盒的說(shuō)明用［α－32P］dCTP標(biāo)記探針。

2.2 Northern雜交 將雜交液在68℃預(yù)熱，加入150 μL(1.5 mg)變性鮭魚精 DNA。將芯片置于雜交管中，加入10 mL的雜交液，預(yù)雜交30 min。棄雜交液，將標(biāo)記好的探針與5 mL雜交液混勻，加入雜交管，68℃雜交過(guò)夜。棄雜交液，200 mL 2×SSC+0.5%SDS，于68 ℃洗膜30 min×3次;200 mL 0.2×SSC+0.5%SDS，于68℃洗膜30 min;最后200 mL 2×SSC，室溫洗膜5 min。將芯片小心取出，濾紙吸去表面殘留液體，以保鮮膜包裹、壓片，于－70℃冰箱顯影，3～7 d后顯影。以u(píng)biquitin為內(nèi)參照。

3 芯片雜交圖像處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別將myosin VI和內(nèi)參照ubiquitin的雜交膠片于相同條件下拍照，使用Labwork軟件對(duì)圖片上的雜交點(diǎn)進(jìn)行灰度值及面積分析，結(jié)果以Excel表格形式呈現(xiàn)。以myosin VI與ubiquitin的比值作為目的基因的相對(duì)豐度。采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)、U檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 組織芯片免疫組化

80例不同病理分級(jí)卵巢上皮腫瘤組織芯片的相關(guān)資料如下:卵巢癌52例(包含漿液性和黏液性)，其中中低分化腺癌(高級(jí)別)33例，高分化腺癌(低級(jí)別)19例;交界性腫瘤16例;囊腺瘤8例及癌旁組織40例。均為手術(shù)切除標(biāo)本，癌旁組織取鄰近腫瘤5 cm以外的正常卵巢上皮組織。采用免疫組化SP法檢測(cè)myosin VI蛋白的表達(dá)情況，染色步驟按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。Ⅰ抗為鼠抗人單抗myosin VI(1∶200稀釋);所使用的Ⅱ抗試劑盒為福州邁新公司的SP試劑盒，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已明確myosin VI蛋白表達(dá)陽(yáng)性的切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。染色結(jié)果以細(xì)胞漿/核內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，著色強(qiáng)度判讀:無(wú)色為陰性(－)，淺黃色為弱陽(yáng)性(+)，黃色為中等陽(yáng)性(++)，棕黃色或棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

結(jié) 果

1 Myosin VI DNA探針合成

使用PCR的方法，在已知的myosin VI全長(zhǎng)mRNA序列中擴(kuò)增一段DNA片段作為探針序列。通過(guò)割膠回收目的條帶并純化后，再次行瓊脂糖凝膠電泳，最終得到單一的目的條帶，見圖1。產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序顯示正確。

Figure 1.The electrophoretogram of myosin VI probe generated by PCR amplification.圖1 PCR擴(kuò)增的myosin VI DNA探針割膠回收電泳圖

2 腫瘤譜陣列芯片雜交結(jié)果

Northern雜交結(jié)果顯示myosin VI在19種腫瘤和癌旁正常組織及10種細(xì)胞株中均有表達(dá)，見圖2。但能用于統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的共有14組(樣本數(shù)較少的膀胱、女性外陰、前列腺、氣管和肝臟共5組未作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)myosin VI在11種腫瘤如卵巢、結(jié)腸、乳腺、胃、肺、胰腺等癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中卵巢癌和結(jié)腸癌組織的表達(dá)豐度與配對(duì)正常組織差異顯著(P＜0.01);而腎、皮膚和睪丸癌組織中myosin VI的表達(dá)是下調(diào)的，見圖3。

Figure 2.The gene expression map of myosin VI on the Cancer Profiling ArrayⅡ.A:the gene expression map of myosin VI;B:the gene expression map of ubiquitin.1:breast;2:ovary;3:colon;4:stomach;5:lung;6:kidney;7:bladder;8:vagina;9:prostate;10:trachea;11:liver;12:uterus;13:cervix;14:rectum;15:thyroid;16:testis;17:skin;18:small intestine;19:pancreas;20:cell lines(from up to down:HeLa，Daudi，K562，HL60，G361，A549，MOLT4，SW480 and Raji).N:normal;T:tumor;UBI:ubiquitin.圖2 Myosin VI在Cancer Profiling ArrayⅡ中的表達(dá)圖譜

Figure 3.Altered expression of myosin VI in diverse human carcinomas and adjacent normal tissues.±s.n=154.＊＊P＜0.01 vs normal.圖3 人體不同癌及其癌旁組織中myosin VI的差異表達(dá)

3 組織芯片免疫組織化學(xué)結(jié)果

Myosin VI只表達(dá)于卵巢上皮細(xì)胞，陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核也有少量表達(dá)。在癌旁及囊腺瘤組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，陽(yáng)性率為10.4%(5/48);交界性腫瘤表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為81.3%(13/16);而在癌組織中均表達(dá)，陽(yáng)性率為100%(52/52)，且表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見圖4、表1。按組織分化程度不同將卵巢腫瘤分為高級(jí)別(中低分化)、低級(jí)別(高分化)和交界性腫瘤共3組，其表達(dá)呈中等陽(yáng)性(++)以上的陽(yáng)性率分別為87.9%(29/33)、73.7%(14/19)和31.3%(5/16)，經(jīng) χ2檢驗(yàn)前兩者差異不明顯(P＞0.05)，但后兩者之間差異顯著(P＜0.05)。Myosin VI在卵巢的交界性上皮腫瘤、低級(jí)別卵巢癌和高級(jí)別卵巢癌的表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，見表1。

討 論

腫瘤譜陣列芯片技術(shù)是從人體不同癌和配對(duì)的癌旁組織中提取的cDNA樣本，呈點(diǎn)狀陣列排布固定于尼龍雜交膜，通過(guò)與靶基因雜交，分析靶基因在不同癌組織中的表達(dá)差異，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于信息量大，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單方便，一次Northern雜交可以分析靶基因在幾十種不同癌組織中的表達(dá)差異，避免多次實(shí)驗(yàn)造成的批次間的實(shí)驗(yàn)誤差并可減少實(shí)驗(yàn)成本，為靶基因功能的深入研究提供依據(jù)［6－7］。

Figure 4.The expression of myosin VI in cystadenoma(A)，borderline ovarian tumor(B)and ovarian carcinoma(C)(immunohistochemical staining，×200).圖4 Myosin VI在囊腺瘤、交界性卵巢腫瘤及卵巢癌中的表達(dá)

表1 Myosin VI在各種卵巢腫瘤及癌旁組織中的表達(dá)Table 1.Differentiated expression of myosin VI in diverse ovarian tumors and adjacent normal tissues

Myosin VI有動(dòng)力馬達(dá)之美稱，能水解ATP酶產(chǎn)生能量推動(dòng)肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng)，從而促使微絲聚合，為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞之間的運(yùn)動(dòng)遷移、物資運(yùn)輸?shù)忍峁﹦?dòng)力。早期的研究顯示myosin VI基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致耳聾和不育，并已證實(shí)其在內(nèi)耳的功能是穩(wěn)定靜纖毛基底的連接［8－9］;表明 myosin VI與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移密切相關(guān)?，F(xiàn)有的報(bào)道顯示myosinVI與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān):Geisbrecht等［10］發(fā)現(xiàn)myosinVI起著維持調(diào)控E－cadherin和beta－catenin蛋白的作用。而Yoshida等［5］通過(guò)果蠅來(lái)模擬人卵巢癌遷移實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)myosinVI在正常的卵巢組織中低表達(dá)，但在高度惡性的卵巢癌中高度表達(dá)，同時(shí)抑制卵巢癌中的myosinVI的表達(dá)量可以減弱腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，提示myosinVI在卵巢癌細(xì)胞的遷移中起到至關(guān)重要的作用。在人的前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)中分化前列腺癌持續(xù)過(guò)表達(dá)myosin VI蛋白，而侵襲性強(qiáng)的前列腺癌組織myosin VI的表達(dá)更強(qiáng)于侵襲性弱的［11－12］;近期文獻(xiàn)報(bào)道免疫組化標(biāo)記 myosin VI、E －cadherin和β－catenin可以作為腎癌診斷的分子標(biāo)志物，與腎癌的預(yù)后相關(guān)［13］。上述研究說(shuō)明myosin VI參與微絲聚合，促使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演極為重要的角色。那是否所有的上皮惡性腫瘤中都有myosin VI的表達(dá)，扮演著腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵因子的作用呢?

本實(shí)驗(yàn)cDNA腫瘤譜列陣芯片包括了源自人體19種不同癌組織和配對(duì)正常組織cDNA樣本及10種腫瘤細(xì)胞株，其中12對(duì)組織各有10對(duì)cDNA樣本，小腸和胰腺各7對(duì)，膀胱5對(duì)，女性外陰5對(duì)，前列腺4對(duì)，氣管3對(duì)，肝臟3對(duì)，連同10種腫瘤細(xì)胞株總共154對(duì)。每對(duì)樣本均取自同一病人的腫瘤組織及癌旁5 cm以外的正常組織，通過(guò)病理學(xué)形態(tài)檢測(cè)無(wú)誤。一次Northern雜交即可完成myosin VI在不同癌組織中的表達(dá)情況，因膀胱等5對(duì)組織樣本量相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)未納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;在其余14種上皮腫瘤中，myosin VI在11種腫瘤如卵巢、結(jié)腸、乳腺、胃、肺、胰腺等癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，其中卵巢癌和結(jié)腸癌組織的表達(dá)豐度與配對(duì)正常組織差異顯著(P＜0.01);而在腎、皮膚、睪丸組織中myosin VI表達(dá)下調(diào);這與 Yoshida等［5］報(bào)道的基本一致。前列腺因其只含有4對(duì)cDNA樣本，未納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因而與Dunn等［11］的報(bào)道有出入。腎癌組織中myosin VI表達(dá)下調(diào)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與前人的研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

卵巢腫瘤組織芯片進(jìn)一步證實(shí)了Northern雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性，免疫組化結(jié)果顯示myosin VI只表達(dá)于卵巢上皮細(xì)胞，陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核也有少量表達(dá)。其在癌旁及囊腺瘤組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，陽(yáng)性率為10.4%(5/48);交界性腫瘤表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為81.3%(13/16);而在癌組織中均表達(dá)，陽(yáng)性率為100%(52/52)。按組織分化程度不同將卵巢腫瘤分為高級(jí)別(中低分化)、低級(jí)別(高分化)和交界性腫瘤共3組，其表達(dá)呈中等陽(yáng)性(++)以上的陽(yáng)性率分別為 87.9%(29/33)、73.7%(14/19)和31.3%(5/16)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)前兩者差異不明顯(P＞0.05)，但后兩者之間差異顯著(P＜0.05)。Myosin VI在卵巢的交界性上皮腫瘤、低級(jí)別卵巢癌和高級(jí)別卵巢癌的表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。這說(shuō)明myosin VI不僅在卵巢癌組織異常高表達(dá)，驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性，還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)myosin VI的表達(dá)與卵巢癌的組織分化程度密切相關(guān)，隨著惡性度的增強(qiáng)其表達(dá)也呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)。本研究提示myosin VI可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。而myosin VI在其它腫瘤如結(jié)腸癌和腎癌中的作用如何將是下一步實(shí)驗(yàn)研究的方向。

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