鞠 斌，王 衛(wèi)，叢 喆，姚 南，陳 霆，杜文達，蘇愛華，高錫強，魏 強

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

RT-SHIV嵌合病毒［1］包含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑靶點，是艾滋病新藥研究中的重要靶病毒［2］。準確了解RT-SHIV病毒rt基因的具體序列信息，對于病毒體內(nèi)復(fù)制動力學(xué)和耐藥突變研究具有重要意義［3］。

傳統(tǒng)PCR方法獲得的目的片段為混合產(chǎn)物，來源于不同的病毒拷貝，且存在模板選擇等問題，無法反映出體內(nèi)病毒變異的真實情況。單拷貝 PCR是近年來新興的一種PCR方法［4］，通過擴增模板的減少來避免序列選擇和重組的發(fā)生，能全面地了解體內(nèi)病毒序列。然而，目前應(yīng)用于單拷貝擴增全長rt基因的方法尚未建立，影響了相關(guān)研究的深入進行［5］。本研究擬建立一種單拷貝 PCR方法，擴增RT-SHIV病毒的全長rt基因，用于病毒體內(nèi)復(fù)制相關(guān)實驗研究。本研究將填補病毒全長 rt基因相關(guān)研究的空白，并且所建立的方法能夠應(yīng)用于各類RT-SHIV和 RT/env-SHIV嵌合病毒，以及 SIV病毒，具有廣泛的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒

以含有SIVmac239全長病毒的質(zhì)粒為骨架，替換進HIV-1rt基因，構(gòu)建的RT-SHIV全長病毒質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建，未發(fā)表)。NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo)測定RT-SHIV全長質(zhì)粒的濃度，依據(jù)公式：

其中，MW=DNA堿基數(shù)(bp)×660daltons/bp

計算拷貝數(shù)，將質(zhì)粒進行10倍系列梯度稀釋，獲得一系列模板濃度。

1.2 血漿樣品

RT-SHIV感染猴血漿(本實驗室儲存)。應(yīng)用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)提取病毒RNA，實時熒光定量 PCR［6］計算拷貝數(shù)約為 300copies/m L。

1.3 設(shè)計并優(yōu)化rt基因特異性擴增引物

使用Oligo軟件設(shè)計6對擴增引物，見表1。

篩選rt基因特異性擴增引物，PCR反應(yīng)體系為25μL，內(nèi)含引物各 0.4mmol/L、Mg2+2mmol/L、dNTP 0.4mmol/L、Taq DNA聚合酶1U和模板2.5μL，94℃預(yù)變性5m in，然后進行35個循環(huán)(94℃變性30s，Tm-5℃退火 30s，72℃延伸 2min ～3.5min)，72℃下保溫10min。6對候選引物分別按上述體系進行PCR反應(yīng)，電泳檢測，篩選出擴增特異性好、效率高、重復(fù)性好的引物。

表1 rt基因擴增引物Tab.1 Amp lification primers of rt gene

1.4 優(yōu)化PCR條件，確定最佳退火溫度和反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)

以引物的理論退火溫度為中心溫度，間隔1℃，共8個梯度，進行梯度 PCR，電泳檢測，同時使用

Image J 1.41軟件(NIH)對電泳圖進行灰度分析，確定出引物的最佳退火溫度。配制一系列PCR反應(yīng)液置于PCR儀中，預(yù)反應(yīng)44個循環(huán)，反應(yīng)進行到14個循環(huán)時取出一管，之后每隔2個循環(huán)取出一管，直至44個循環(huán)結(jié)束，電泳檢測，確定出反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)。

1.5 確定單拷貝PCR擴增最適模板濃度

使用上述方法擴增RT-SHIV全長rt基因，梯度稀釋質(zhì)粒模板，直至擴增陽性率小于30%，按照泊松分布，此時擴增產(chǎn)物為單拷貝序列［7］。

1.6 血漿中 RT-SHIV病毒全長 rt基因的單拷貝PCR擴增

從 RT-SHIV感染猴血漿樣本中提取出病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，使用本文建立的方法擴增RT-SHIV全長rt基因，然后進行有限地稀釋，擴增單拷貝序列，電泳檢測，諾賽公司序列測定，BioEdit軟件序列分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)?？截悢?shù)的計算

RT-SHIV質(zhì)粒全長為13216bp，分光光度計測定質(zhì)粒濃度為150ng/μL，按上述公式計算質(zhì)粒濃度約為1×1010copies/μL，10倍系列稀釋至1×102copies/μL，得到9個不同的模板濃度。

2.2 篩選rt基因特異性擴增引物

6對引物以高濃度(拷貝數(shù)為 1×106copies/μL)質(zhì)粒作模板進行初篩，電泳檢測，如圖1所示，使用引物RT-out-F/R擴增時，所得產(chǎn)物特異性較差，在約400bp處存在明顯的非特異性擴增，條帶較弱擴增效率也不高，雖然陽性率高達100%，但各平行管間重復(fù)性較差，使用Image J軟件灰度掃描后比對各平行管間差異較大，變異系數(shù)(CV%)為72.46遠高于其他引物，不適合作為擴增 rt基因引物。

剩余5對引物低濃度(拷貝數(shù)為1×104copies/μL)質(zhì)粒作模板繼續(xù)篩選，電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，只有引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R擴增陽性率為100%，且沒有出現(xiàn)非特異性擴增、擴增特異性好，平行管間亮度比較一致、重復(fù)性高，而其余引物擴增陽性率均未達到100%、條帶亮度較弱、擴增效率不高，同時如引物TC-out-F2/R2結(jié)果所示，平行管間亮度差別較大、擴增重復(fù)性較差。使用Image J軟件灰度掃描也得出一致的結(jié)果，如表2所示，擴增陽性率最高的為引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R，均達到了100%；產(chǎn)物產(chǎn)量最高的是引物TC-out-F2/R2，但其標準差較大，平行管間重復(fù)性較差；變異系數(shù)最小的為引物TC-F2/R2，其次是 RT-F/R和TC-out-F1/R1，但是引物TC-F2/R2的擴增陽性率最低，僅為60%。故綜合擴增特異性、陽性率、效率和重復(fù)性等條件考慮，選擇引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R作為特異性擴增rt基因的外套和內(nèi)套引物。

圖1 RT-out-F/R擴增產(chǎn)物注：1：陰性對照 2-7：RT-out-F/R擴增產(chǎn)物M：DL5000Fig.1 Amplification products of RT-out-F/RNote：1：Negative control；2-7：Amplification products ofRT-out-F/R；M：DL5000

表2 5對引物擴增比較結(jié)果Tab.2 Comparison of the amplification results of the five pairs of primers

2.3 最佳退火溫度的確定

隨著退火溫度的改變，PCR擴增效率發(fā)生明顯變化，效率最高處即定為最佳退火溫度，引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R的最佳退火溫度范圍分別為(46.4～48.6)℃和(49.4～50.4)℃，見圖3，最終選擇為48℃和50℃。

2.4 PCR反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)的確定

選取PCR反應(yīng)過程中第14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44個循環(huán)時分別檢測產(chǎn)物擴增量，從圖4A中可以看出，使用 TC-out-F1/R1引物擴增時，從20個循環(huán)開始出現(xiàn)目的條帶，隨著循環(huán)數(shù)的增加，亮度逐漸增加，當循環(huán)數(shù)至34個時，可以看到清晰的條帶，隨著循環(huán)數(shù)的增加，目的基因產(chǎn)量并沒有明顯增加，表明PCR反應(yīng)已至平臺期，使用TC-out-F1/R1引物擴增的最佳循環(huán)數(shù)為34個循環(huán)。同理，使用RT-F/R引物從36個循環(huán)開始反應(yīng)進入平臺期，最佳循環(huán)數(shù)為36個循環(huán)。使用Image J軟件灰度掃描也得出一致的結(jié)果，如圖4所示，引物TC-out-F1/R1和RT-F/R分別在第34和36個循環(huán)時，反應(yīng)進入平臺期，最終最適循環(huán)數(shù)分別為34和36個循環(huán)。

圖2 5對引物擴增產(chǎn)物注：1，7，13，19，25：陰性對照；2-6：TC-out-F1/R1，2527 bp；8-12：TC-out-F2/R2，2383bp 13-18：TC-F1/R1，1986bp；20-24：TC-F2/R2，1945bp；25-30：RT-F/R，2186bp；M：DL5000Fig.2 Amplification products of the 5pairs of primersNote：1，7，13，19，25：Negative control；2-6：TC-out-F1/R1，2527 bp；8-12：TC-out-F2/R2，2383bp；13-18：TC-F1/R1，1986bp；20-24：TC-F2/R2，1945bp；25-30：RT-F/R，2186bp；M：DL5000

圖3 梯度PCR結(jié)果 (A：TC-out-F1/R1，B：RT-F/R)Fig.3 Rsults of gradient PCR(A：TC-out-F1/R1，B：RT-F/R)

圖4 不同循環(huán)數(shù)PCR結(jié)果(A：電泳結(jié)果；B：灰度分析結(jié)果)Fig.4 The results of PCR with different number of cycles(A：Results of electrophoresis.B：Gray value analysis)

2.5 確定單拷貝PCR擴增最適模板濃度

有限稀釋的模板一輪 48℃退火，34個循環(huán)；二輪50℃退火，36個循環(huán)，電泳檢測，如圖5所示，模板濃度為1×103copies/μL時，擴增陽性率達80%，未達到單拷貝要求；當模板濃度為1×102copies/μL時，擴增陽性率為20%，符合單拷貝PCR要求。

2.6 單拷貝PCR擴增血漿中RT-SHIV病毒全長rt基因

使用本文建立的方法擴增載量約為300copies/mL的RT-SHIV感染猴血漿樣本中全長 rt基因，電泳檢測，如圖6所示，該方法擴增所得產(chǎn)物特異性好、擴增效率高；將模板進行10倍稀釋，擴增陽性率約為66%，20倍稀釋后陽性率約為16%，進而估算出要想達到單拷貝PCR低于30%陽性率的要求，需進行約16倍稀釋。將單拷貝PCR模板所需稀釋度與病毒載量結(jié)果聯(lián)系起來，使得所建立的方法更加方便準確。

圖5 10倍稀釋標準品電泳結(jié)果注：1，7：陰性對照；2-6：1×103 copies/μL；8-12：1×102 copies/μL；M：DL5000Fig.5 Results of electrophoresis obtained from 10-fold serial dilutions of standardNote：1，7：Negative control；2-6：1×103 copies/μL；8-12：1×102 copies/μL；M：DL5000

圖6 RNA模板電泳結(jié)果注：M：DL5000；1-6：10倍稀釋；7-12：20倍稀釋Fig.6 Results of electrophoresis obtained from the RNA templateNote：M：DL5000；1-6：10-fold dilution；7-12：20-fold dilution

2.7 HIV－1rt基因序列分析

HIV-1rt基因全長1680bp，包括聚合酶區(qū)、連接區(qū)和RNase H區(qū)，測序結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物含有全長的rt基因，未發(fā)生重組，病毒在體內(nèi)復(fù)制過程中存在變異，本文初步分析了 RT-SHIV感染猴 d266和d294樣本，結(jié)果顯示，與原始序列相比，d266樣本全長rt基因只發(fā)生了1處M403I氨基酸改變；而d294樣本全長rt基因發(fā)生了6處氨基酸改變，分別是E29K、E42K、G196R、R311K、M403I、E514K。該方法能夠準確地反應(yīng)病毒序列的真實情況，為研究分析艾滋病猴模型中病毒遺傳變異情況打下了良好的基礎(chǔ)。

3 討論

HIV-1的rt基因是抗病毒治療的一個重要靶點，然而在體內(nèi)復(fù)制過程中極易產(chǎn)生突變，尤其是多種耐藥性突變的出現(xiàn)會導(dǎo)致抗病毒治療的失敗，通過擴增得到盡可能多的病毒序列，真實反映體內(nèi)病毒遺傳變異情況，研究體內(nèi)病毒群體多樣性和治療過程中rt基因的序列變異情況，對于抗病毒藥物的篩選以及新藥的研發(fā)有著重要的意義。但是，目前尚未建立起完善的rt基因檢測手段，阻礙了相關(guān)研究的進展。

本文建立了較成熟的RT-SHIV全長rt基因單拷貝PCR擴增方法，可對全長rt基因進行序列分析，兩對引物TC-out-F1/R1和RT-F/R的最佳退火溫度分別為48℃和50℃，反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)分別為34和36個循環(huán)。當模板濃度為100copies/μL時，擴增得到單拷貝序列，能夠擴增出大量的全長rt基因，最大程度上反應(yīng)了體內(nèi)病毒序列的真實信息。同時，由于兩對引物定位于RT-SHIV病毒的SIV骨架上，故可應(yīng)用于各類 RT-SHIV和SIV病毒，具有廣泛的應(yīng)用范圍。使用該方法從感染猴血漿中擴增RT-SHIV全長rt基因，特異性強，擴增效率高，血漿載量為300copies/mL的樣本經(jīng)16倍稀釋后，所得產(chǎn)物為單拷貝序列。初步分析了RT-SHIV感染猴體內(nèi)病毒的rt基因，能夠監(jiān)測到病毒在體內(nèi)復(fù)制過程中氨基酸的變異情況。

傳統(tǒng)的PCR方法得到的是混合型產(chǎn)物，來源于不同的病毒拷貝，測序分析時會遺漏掉許多重要的序列信息。而本文建立的方法通過有限地稀釋模板，能夠擴增出大量的單拷貝序列，最真實地反應(yīng)出體內(nèi)病毒的序列情況。

全長rt基因為1680bp，包括聚合酶區(qū)、連接區(qū)和RNase H區(qū)，由于聚合酶區(qū)是藥物的最主要靶點，所以過去研究的重點就在于 rt基因的前 600bp，同時也建立起了單拷貝 PCR擴增方法［8］。但是，近年來又發(fā)現(xiàn)rt基因的其他區(qū)域發(fā)生突變也會改變病毒對藥物的敏感性［9］，然而，目前尚沒有建立起全長rt基因的單拷貝PCR擴增方法，阻礙了病毒體內(nèi)遺傳與變異的研究，本文建立的方法具有重大的應(yīng)用價值。

建立RT-SHIV全長rt基因單拷貝PCR擴增方法的最終目的是應(yīng)用于病毒遺傳與變異的研究，一個方法建立需要大量的實驗實踐來評估和驗證，而本文擴增的RT-SHIV感染猴血漿樣本較少，只對該方法的初步應(yīng)用進行了探討，尚未對猴體內(nèi)病毒遺傳變異情況進行深入探討，接下來的工作就是大量擴增RT-SHIV感染猴血漿樣本，進一步驗證所建立的單拷貝方法，同時深入探討猴體內(nèi)病毒遺傳與變異情況。

該方法的建立有助于研究各類RT-SHIV模型中全長rt基因的序列信息和病毒的遺傳變異情況，以及在抗病毒治療壓力下耐藥突變的產(chǎn)生和進化機制，為抗病毒藥物和疫苗的篩選和研發(fā)提供堅實的基礎(chǔ)。

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