崔 智，李曉娟，白云峰，侯 俊，戴廣海，李瑞生

(1.解放軍總醫(yī)院腫瘤綜合治療科，北京 100853；2.解放軍第302醫(yī)院實驗技術保障中心，北京 100039)

隨著生命科學的不斷發(fā)展，越來越多的模型動物被廣泛地應用于臨床實驗研究中。2001年 Song C等［1］在哺乳動物中克隆出與 PLC210同源序列的PLC，由于與其他已知的PLC不同，因而被命名為PLCε，2003年采用基因打靶法成功建立了 PLCε基因敲除小鼠。該模型小鼠其繁殖后代中有敲基因型、雜合型和野生型等三種混合類型，但從外觀表型上很難鑒別其各自不同的基因類型。微衛(wèi)星DNA標記技術是采用多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點來對遺傳物質(zhì)DNA直接進行監(jiān)測，以分析其遺傳特性，該技術在大小鼠遺傳監(jiān)測中得到了廣泛應用，并驗證了它的準確性和可靠性［2］。因此，本研究應用所篩選的13個具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA位點和2個通過敲除基因序列自行設計的引物，對PLCε基因敲除小鼠群體的遺傳背景進行有效地遺傳質(zhì)量監(jiān)測，旨在分析其遺傳背景特性和鑒別所生產(chǎn)繁殖的三種(敲基因型、雜合型和野生型)不同基因類型小鼠，為今后進行模型動物的研究和開發(fā)利用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

PLCε基因敲除小鼠來源于日本神戶大學，由解放軍第302醫(yī)院動物實驗中心生產(chǎn)繁殖，隨機選取6～8周齡小鼠28只，雌雄各半，編號1～14號為雌性，15～28號為雄性，單鼠體質(zhì)量為20g～25g，動物實驗室飼養(yǎng)條件為SPF級，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)-2007-010。剪小鼠尾巴，-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 藥品與生化試劑

硝酸銀、冰醋酸、三羥甲基胺基甲烷、過硫酸銨、無水碳酸鈉、甲醛、無水乙醇，DNA提取緩沖液，Taq DNA聚合酶和10×buffer(寶生物公司)，dNTP (Sangon公司)，TEMED(Sigma公司)。

1.3 引物合成

選擇具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星 DNA位點：D1Mit365、D3Mit51、D4Mit235、D6Mit102、D7Mit281、D8Mit113、 D9Mit23、 D10Mit180、 D13Mit88、D16Mit145、D17Mit36、D18Mit94、D19Mit97、Dq(敲基因型)和Dy(野生型)等15個微衛(wèi)星基因座位點，這些位點引物序列均來自參考文獻［3，4］，由上海生物工程技術有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提?。簩?8只小鼠尾巴各剪取1cm左右，剪細碎后放于2.0m L EP管內(nèi)，加入30μL～35μL蛋白K及470μL DNA提取緩沖液，將其上下顛倒充分混勻后，置于 37℃水浴鍋內(nèi)過夜，待其全部消化溶解后，用等體積的Tris飽和酚和三氯甲烷分3次進行抽提DNA，用冰無水乙醇析出基因組DNA，干燥后用(50～200)μL TE全部溶解，然后用紫外分光光度計測其樣品的純度和濃度，配制成100ng/uL左右，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR的擴增：每個PCR擴增體系為50μL，緩沖液 buffer 5μL，上下游引物各 0.2μmol/L，dNTP 200μmol/L，Taq酶1U，DNA模板為1μL。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，48℃ ～65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)25～30次，最后一個循環(huán)延伸 7 min，擴增產(chǎn)物于 4℃冰箱內(nèi)保存。

1.4.3 電泳與銀染檢測；抽取已加入染料的PCR擴增產(chǎn)物10μL，注入8%聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中，200V電泳1h～2h。電泳后的凝膠用10%冰醋酸固定，硝酸銀染色，碳酸鈉顯色，待條帶清晰后，用終止液停顯。然后進行圖帶拍照保存分析。

1.4.4 結(jié)果判讀與分析：根據(jù)電泳后聚丙烯酰胺凝膠上的DNA圖帶，其泳動距離遠近進行判讀，按泳動距離遠近設定為阿拉伯字母1、2、3……N，如果DNA圖帶泳動距離一致，可判定為單態(tài)性，若有差異可判定為多態(tài)性［5］。對于 Dq和 Dy兩個位點的電泳圖帶，如果只有Dy位點有圖帶，而Dq位點沒有圖帶，可判定為野生型；如果Dq和Dy兩位點都有擴增圖帶，可判定為雜合型；若只有Dq位點有圖帶，而Dy位點沒有擴增圖帶，則可判定為敲基因型。

2 結(jié)果

2.1 15個微衛(wèi)星DNA位點PCR擴增條件分析

利用1號小鼠DNA對所篩選的15個微衛(wèi)星DNA位點的各種濃度梯度條件進行了PCR擴增，通過對凝膠電泳圖帶的清晰程度、泳動距離進行了對比分析，獲得各個微衛(wèi)星DNA位點最佳Mg2+濃度、退火溫度、擴增片段大小和擴增循環(huán)次數(shù)等擴增條件(表1)。

表1 15個微衛(wèi)星DNA位點最佳PCR擴增條件Tab.1 The best conditions of PCR amplification of 15microsatellite DNA loci

圖1 D3Mit51位點擴增的DNA圖譜注：M：為marker，1-14：為1號-14號小鼠個體Fig.1 DNA mapping of amp lification of D3M it51locusNote：M：Marker；1-14：For 1-14individuals of mice

2.2 13個多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點PCR擴增結(jié)果的分析

利用所獲得的13個多態(tài)性微衛(wèi)星DNA位點的最佳PCR擴增條件對28只小鼠分別進行了擴增，結(jié)果每個微衛(wèi)星DNA位點的28只小鼠所擴增出來的圖帶其泳動距離一致，均呈單態(tài)性，其中D3Mit51位點單態(tài)性的擴增圖譜結(jié)果(圖1)。說明了此小鼠遺傳背景呈現(xiàn)一致性，沒有發(fā)生遺傳變異，保持了遺傳的穩(wěn)定性。

2.3 Dq和Dy兩個位點三種基因型的鑒別分析

利用Dq和Dy兩個位點對28只小鼠進行了PCR擴增，其電泳圖帶結(jié)果發(fā)現(xiàn)4，6，11，16，19和23號小鼠的Dq位點有圖帶，而Dy位點沒有圖帶，則可判定為敲基因型；5，9，14，17，21，22和28號小鼠的Dy位點有圖帶，而Dq位點沒有圖帶，則可判定為野生型；而1，2，3，7，8，10，12，13，15，18，20，24，25，26和27號小鼠的Dq和 Dy兩位點都有擴增圖帶，則可判定為雜合型。其中1-8號小鼠Dy和Dq兩位點的PCR擴增圖帶(圖2和圖3)。

圖2 Dy位點擴增的DNA圖譜注：M：為Marker，1-8：為1-8號小鼠個體Fig.2 DNA mapping of amplification of Dy locusNote：M：Marker；1-8：For individuals 1-8of mice

3 討論

小鼠微衛(wèi)星基因座位點存在于整個基因組中，其核心序列為2～6bp的串聯(lián)重復序列，重復次數(shù)達幾次甚至幾十次，由于其重復次數(shù)的不同而呈現(xiàn)出微衛(wèi)星DNA位點的高度多態(tài)性。正是利用此特點可以對近交系、封閉群、雜合群及不同品系動物的遺傳背景進行有效地監(jiān)測分析，目前在小鼠基因圖譜中包含了7 377個微衛(wèi)星DNA位點，其中有6580個顯示多態(tài)性［6］。本實驗所選取的敲基因小鼠是來源于日本神戶大學實驗室［7］，由302醫(yī)院動物實驗中心保種繁殖，沒有引入外來血緣。人們采用基因敲除技術已建立了許多人類疾病動物模型，如敲基因小鼠模型［8］、膀胱癌動物模型［9］、皮膚癌動物模型［10］、前列腺癌動物模型［11］等，但這些敲基因動物模型的遺傳背景是否發(fā)生了改變，以及變異的程度還不是很清楚。因此，本實驗利用所篩選的13個多態(tài)性高的微衛(wèi)星DNA位點對所選取的28只成年小鼠進行了遺傳背景的質(zhì)量監(jiān)測，結(jié)果顯示13位點均呈現(xiàn)一條圖帶且泳動距離一致，說明該位點純合且呈單態(tài)性，從而說明了該群體的遺傳背景均一，沒有發(fā)生遺傳污染或遺傳變異，符合實驗動物近交系的基本要求。因此，應用微衛(wèi)星DNA標記技術可以進行純合位點的判定，同時也能對位點的變異情況進行分析，適于近交系動物的遺傳質(zhì)量檢測［12］。這些高度多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA位點曾在不同品系大小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測中得到過有效驗證［13，14］。

圖3 Dq位點擴增的DNA圖譜注：M：為Marker，1-8：為1-8號小鼠個體Fig.3 DNA mapping of amplification of D3Mit51locusNote：M：Marker；1-8：For individuals 1-8of mice

該群體小鼠是嚴格按照雜合型自交方式來進行繁殖，按照孟德爾遺傳學繁殖規(guī)律所產(chǎn)生的繁殖后代均會出現(xiàn)三種不同的基因型［15］，但從外觀上很難鑒別。因此，本實驗利用2個特殊位點對所選取的28只成年小鼠進行了遺傳背景分析，鑒別出敲基因型小鼠6只，野生型小鼠7只和雜合型小鼠15只，該方法可以有效地鑒別出三種不同基因型小鼠，為今后該小鼠的應用和實驗研究提供了可靠的保障［16］。

［1］Song C，Hu CD，Masago M，et al.Regulation of a novel human phospholipase C，PLC epsilon，through membrane targeting by Ras［J］.J Biol Chem，2001，276(4)：2752-2757.

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