陳 娟，張景燕，王 蓉，趙靜姝，郭 瑾，吳燕川，趙志煒

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室，北京老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053；2.中國人民解放軍總醫(yī)院301超聲診斷科)

神經(jīng)退行性疾病的共同特征是特定區(qū)域神經(jīng)元功能的喪失，即神經(jīng)元的不可逆損傷、死亡。越來越多證據(jù)表明，氧化應(yīng)激參與了神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制，在阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、腦卒中等疾病中都發(fā)現(xiàn)了自由基增多導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，增多的氧自由基能攻擊蛋白質(zhì)、脂肪酸和脂質(zhì)膜，從而破壞細(xì)胞的功能和完整性。因此，減少神經(jīng)元內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，對保護(hù)神經(jīng)元、延緩衰老及對抗損傷有重要意義［1］。

熱量限制飲食在很多物種中能夠改善健康和延緩衰老，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，熱量限制飲食可以減少多種與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)生［2］，但至今其延緩衰老的機(jī)制尚未十分清楚。有研究表明，熱量限制延緩衰老可能機(jī)制之一是抗氧化應(yīng)激［3］。熱量限制大大降低了腦、心臟和肝臟中線粒體活性氧物質(zhì)的產(chǎn)率，可能是延緩衰老進(jìn)程的一個基本機(jī)制［4］。本實驗擬通過觀察低熱量培養(yǎng)對過氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的影響，為進(jìn)一步探討熱量限制在氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株 SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院。

1.1.2 試劑：噻唑蘭(MTT)購自 Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購自北京亞太精細(xì)化工公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒，購自北京化工廠，編號001012，30%過氧化氫購自北京化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理：細(xì)胞用 DMEM*F12(Gibco)培養(yǎng)基培養(yǎng)(3.0g/L-glucose)，加入10%胎牛血清、青霉素 100IU/m L、鏈霉素100IU/m L于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%時，分組處理：對照組及損傷組，換用DMEM ×F12加入1%血清，培養(yǎng)24h；低糖組及低糖+損傷組，換用低糖組培養(yǎng)基為DMEM(2.0g/L-glucose)加1%胎牛血清，培養(yǎng)24h；予以250μmol/L的H2O2分別損傷1h和7 h。用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT代謝率測定：將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞接種密度1.0×104/孔，待細(xì)胞貼壁生長至70%～80%時予以相應(yīng)處理，加入MTT溶液(5.0g/L)20uL繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO作用10m in后，用全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum)測定570nm處光密度值。

1.2.3 細(xì)胞生長形態(tài)觀察：用倒置顯微鏡(Olympus產(chǎn)品)觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，比較對照組和實驗組細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.4 LDH漏出率測定細(xì)胞培養(yǎng)方法：同前，按照LDH試劑盒所示方法(比色法)，測定570nm處光密度值，同時做條圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS11.5軟件統(tǒng)計分析，資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析(One Way ANOV)及重復(fù)資料的方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義，P＜0.01認(rèn)為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測定

不同濃度過氧化氫作用1h后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示隨著過氧化氫濃度的增加，細(xì)胞活力呈遞減趨勢(圖1)。

圖1 不同濃度過氧化氫對細(xì)胞活力的影響注：與對照組相比＊＊P＞0.05；##P＜0.01。誤差條：±2sFig.1 Effect of different concentrations of hydrogen peroxide on the SH-SY5Y cells viabilityNote：＊＊P＞0.05，vs.control group；##P＜0.01，vs.control group

用250μmol/L過氧化氫分別處理1h和7 h，和對照組比較，低糖組活力明顯上升；與損傷組比較，低糖+損傷組活力上升(圖2)。

2.2 LDH漏出率測定結(jié)果

與空白組比較，損傷組漏出率明顯增加，P＜0.05，低糖組1h漏出率稍有減少，P＞0.05；與損傷組比較，低糖 +損傷組1h漏出率明顯減少，P＜ 0.01，繼續(xù)培養(yǎng)至7 h顯示，低糖組漏出率由(1.154±0.062)增加至(1.223±0.107)；低糖+損傷組漏出率由(1.128±0.542)增加至(1.262±0.081)，P＜0.01(圖3)。

圖2 熱量限制對過氧化氫損傷不同時間段的影響注：損傷1h，與空白組比較，*P＜0.01；與損傷組比較，*P＜0.01；損傷7 h，與空白組比較，＊＊P＜0.01；與損傷組比較，＊＊P＜0.01。誤差條：±2sFig.2 Effect of caloric restriction for different times on thehydrogen peroxide-induced cell damage Note：Damaged for 1hour，*P＜0.01，vs.control group；*P＜0.01，vs.H2 O2 group；damaged for 7 h，＊＊P＜0.01，vs.control group；＊＊P＜0.01，vs.H2 O2 group.

圖3 LDH漏出率測定注：圖3為過氧化氫損傷1h的細(xì)胞LDH漏出率。與空白組比較，*P＞0.05；與損傷組比較，＊＊P＜0.01。誤差條：±2sFig.3 The LDH leakage rates in the cells of different groupsNote：H2 O2-treated for 1hour.*P＞0.05，vs.control group；＊＊P＜0.01，vs.H2 O2 group

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖4、5、6(見彩插1)所示為各組細(xì)胞在不同處理時段的細(xì)胞形態(tài)。圖4為未加損傷之前，空白組、低糖組的細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)與對照組比較無明顯改變。圖5為加入損傷藥物1h后的細(xì)胞形態(tài)與未加損傷錢比較無明顯改變，圖6為加入損傷藥物7 h后的細(xì)胞形態(tài)，低糖組和空白組細(xì)胞突起伸展良好細(xì)長，損傷組可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少，死細(xì)胞多，細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞明顯變圓，貼壁性不好，透光性差。

3 討論

熱量限制(caloric restriction，CR)是指一種有計劃的減少由食物提供的熱量的進(jìn)食方式，一般指在生物體所攝入營養(yǎng)成分在保證其不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，將正常自由進(jìn)食所得的熱量減去30% ～50%。早在20世紀(jì)30年代，McCay等［5］人就發(fā)現(xiàn)限制食物的攝入就能延長嚙齒類動物的壽命。許多學(xué)者運(yùn)用熱量限制的方法在從酵母到靈長類動物中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果［6］。在熱量限制的動物和志愿者，可以看到一個穩(wěn)定的生理變化：較低的體溫、較低的血糖和胰島素水平、以及脂肪和體重的降低［7］、較強(qiáng)的應(yīng)激耐受能力，包括熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激。神經(jīng)元衰老機(jī)制研究中，氧化應(yīng)激是加速神經(jīng)元衰老的主要原因之一，雖然神經(jīng)元衰老的機(jī)制仍不是很清楚，但長期以來一直認(rèn)為氧化應(yīng)激、DNA損傷可能是神經(jīng)元衰老的關(guān)鍵原因［8］。

本實驗觀察到在細(xì)胞生長至對數(shù)期后給予低糖預(yù)處理24h，過氧化氫損傷1h(短期)和7 h(長期)，MTT代謝率及LDH漏出率測定顯示低糖組活力較損傷組活力明顯增高，低糖組細(xì)胞形態(tài)維持良好，而損傷組細(xì)胞突觸回縮，形態(tài)變圓，懸浮細(xì)胞和死細(xì)胞增多，顯示低糖對短時間的急性氧化應(yīng)激損傷和長期的氧化應(yīng)激損傷都能起到一定的保護(hù)作用，這一結(jié)論與近年研究的熱量限制抗氧化損傷的結(jié)論相符［9］，低糖通過模擬熱量限制的作用，降低線粒體活性氧類物質(zhì)的生成，上調(diào)相關(guān)解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化酶水平，使機(jī)體內(nèi)活性氧類物質(zhì)生成減少，清除提高，從而發(fā)揮很好的抗氧化損傷作用［10，11］；也提示我們，在日常生活中減少碳水化合物的攝入的比例有益于提高自身的抗氧化應(yīng)激能力，保持身體健康，延緩衰老?？傊?，CR是一個生物體主動調(diào)節(jié)的過程，其延緩衰老的作用可能是通過促進(jìn)線粒體增殖進(jìn)而降低自由基水平來實現(xiàn)的［12］。本實驗為熱量限制抗氧化應(yīng)激損傷提供了重要的理論依據(jù)。

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