王諄

(鄭州市第三人民醫(yī)院普外科，鄭州450000)

結腸癌、直腸癌在臨床較常見，侵襲和轉移是其預后不良的重要因素。claudins家族是構成細胞緊密連接的重要成分之一，其異常表達與腫瘤的侵襲轉移相關，目前人們關注最多的是claudin-7［1］。上皮黏附素(E-cadherin)對調節(jié)細胞外的黏附有重要作用，近年來相關研究認為其與claudins家族可能具有協(xié)同作用［2］。本實驗對結腸癌、直腸癌標本進行claudin-7和E-cadherin的流式細胞學檢測，探討其臨床價值，以期為臨床研究結腸癌、直腸癌的發(fā)展及判斷預后提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年6月至2008年12月在我院確診為結腸癌、直腸癌并進行手術的患者122例為觀察組，其中男62例，女60例，年齡36～78(53.3 ±5.4)歲，留取新鮮組織，并于 -80℃冰箱中保存。上述患者均符合WHO關于結腸癌、直腸癌的診斷標準。排除標準:術前放、化療的患者、臨床資料不完整的患者。收集同期經(jīng)病理證實為正常結腸黏膜組織的患者60例為對照組，其中男30例，女30例，年齡36～79(52.5±5.7)歲，保存方法同上。兩組患者在性別、年齡等方面比較差異無統(tǒng)計學意義，具有均衡性。

1.2 方法 claudin-7和E-cadherin蛋白均購自武漢博士德公司。claudin-7和E-cadherin的檢測采用流式細胞術。將凍存組織取出，置于75%的乙醇中固定72 h后，將組織放在120目的不銹鋼網(wǎng)上，剪碎后輕搓，并用0.9%的氯化鈉溶液沖洗。收集混懸液后離心，并制成1×106/mL的單細胞懸液。分別取1 mL加入 claudin-7或 E-cadherin蛋白，室溫放置30 min后加入磷酸鹽緩沖液10 mL，離心，去上清液，加異硫氰酸熒光素-IgG二抗100 μL，避光放置30 min，加入磷酸鹽緩沖液10 mL，離心，棄上清后加磷酸鹽緩沖液0.1 mL，過濾后應用流式細胞儀進行檢測［3］。采用美國BD公司生產流式細胞儀進行檢測，并用系統(tǒng)自帶軟件進行分析。

1.3 結果判斷方法 應用的方法計算出熒光指數(shù)表示蛋白的相對含量［3］。熒光指數(shù)=(蛋白表達的平均熒光強度-對照樣本的平均熒光強度)/(正常對照樣本的表達-對照樣品的平均熒光強度)

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差)表示，采用t檢驗;計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;相關分析采用Pearson線性相關分析;生存分析應用Kaplan-Meier法，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組claudin-7和E-cadherin的表達 兩組claudin-7和E-cadherin比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) (表1)。

表1 兩組claudin-7和E-cadherin的表達 (%)

2.2 觀察組claudin-7和E-cadherin在不同臨床病理特征中的比較 claudin-7和E-cadherin在不同腫瘤直徑、Dukes分期、Ki67值及有無淋巴結轉移的結腸癌、直腸癌患者中比較差異有統(tǒng)計學意義(表2)。

2.3 兩組claudin-7和E-cadherin表達的相關性分析 觀察組claudin-7與E-cadherin蛋白的表達呈正相關(r=0.45，P＜0.05);對照組claudin-7與E-cadherin的表達未見明顯相關性(r=0.12，P＞0.05)。

2.4 觀察組claudin-7和E-cadherin表達的生存分析 以熒光指數(shù)≥1.0為陽性，結腸癌、直腸癌claudin-7陽性患者3年生存率為85%(34/40)，claudin-7陰性患者3年生存率為29.23%(24/82)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.54，P＜0.05);結腸癌、直腸癌E-cadherin陽性患者3年生存率為83.8%(31/37)，E-cadherin陰性患者3年生存率為31.8%(27/85)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.42，P＜0.05)，claudin-7和E-cadherin低表達患者的預后較差。

3 討論

結腸癌、直腸癌臨床常見，腫瘤細胞在轉移過程中細胞間的黏附作用降低，細胞連接松散。鈣黏附素是一組Ca2+依賴跨膜蛋白，包括至少9個基因家族，主要參與介導鈣離子依賴的同型細胞間的黏附，在維持正常組織結構方面發(fā)揮著重要作用。也有觀點認為E-cadherin是介導同型細胞相互黏附的跨膜糖蛋白［2］。在正常組織中E-cadherin遍布在胚胎組織和上皮細胞中，不僅有調節(jié)原始胚胎組織發(fā)育的作用，還參與細胞間的物質的交換和信息的交流，同時對保持細胞、組織的完整性有重要價值。在E-cadherin的表達丟失時，引起同質類型細胞黏附性差，并脫離原發(fā)灶，具有血行和淋巴道轉移的潛能［4］。claudins是構成緊密連接的骨架蛋白，是緊密連接結構與功能的重要組成成分。Claudins家族的NH2-和COOH-端位于細胞內部，C末端可與內層的蛋白(如ZO-1、ZO-2等)分子連接;細胞外的肽鏈可以形成兩個跨膜的環(huán)，這兩個環(huán)可以和鄰近的其他細胞的同種類型環(huán)相接觸而行使功能［5-6］。claudin-7是Claudins多基因家族中的重要成員之一，目前認為claudin-7是潛在的腫瘤抑制劑［7-8］。

本實驗結果顯示，結腸癌、直腸癌中claudin-7和E-cadherin低表達，提示兩者對腫瘤發(fā)生有重要作用，即claudin-7和E-cadherin高表達可以抑制腫瘤的發(fā)生，反之亦然。實驗結果顯示 claudin-7和E-cadherin的表達與腫瘤直徑、Dukes分期、Ki67值及淋巴結轉移有一定關系，由于以上因素均與患者的預后相關，提示claudin-7和E-cadherin的表達可能與預后有一定關聯(lián)。生存分析直接證實了claudin-7和E-cadherin與預后的相關性。實驗結果顯示，claudin-7和E-cadherin的表達呈正相關，提示兩者具有協(xié)同作用。E-cadherin的異常表達可以促進腫瘤的浸潤和轉移，其異常表達時引起癌細胞從原發(fā)灶的癌組織中分離并脫落，同時引起N-cadherin的表達增強，使腫瘤細胞與脈管的內皮細胞或周圍的基質成分的黏附性增強，引起轉移的發(fā)生。因此，Claudin-7蛋白可以成為細胞與細胞間緊密連接成分的重要基礎，對細胞的屏障功能和極性的維持有重要價值，此結構可以有效地限制癌細胞的營養(yǎng)供應，進而發(fā)揮抑癌作用。當Claudin-7蛋白低表達時，細胞的緊密連接功能損害，細胞與細胞間松散，此時與E-cadherin引起的黏附性下降共同作用，引起腫瘤擴散的發(fā)生，同時也可以使腫瘤生長時產生的促腫瘤生長因子隨之擴散。E-cadherin還對腫瘤細胞與血管平滑肌細胞或外皮細胞之間的黏附發(fā)揮著重要作用，主要表現(xiàn)為促進腫瘤間質的血管形成及腫瘤細胞-間質細胞的遷移，使腫瘤更加富有侵襲性［9］。

綜上所述，結腸癌、直腸癌中claudin-7和E-cadherin異常表達，兩者在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，術后聯(lián)合檢測claudin-7和E-cadherin的表達對判斷結腸癌、直腸癌的預后有重要價值。

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