黃福生，黎漢忠，劉志輝，王洪學(xué)，李永強(qiáng)※

(1.扶綏縣人民醫(yī)院普外科，廣西扶綏532100;2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院化療一科，南寧530021)

乳腺癌為常見的人類惡性腫瘤。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，乳腺癌為最常見的女性惡性腫瘤［1］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為我國(guó)屬于乳腺癌相對(duì)低發(fā)地區(qū)，然而近年來我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［2］，這種態(tài)勢(shì)在生活水平高的地區(qū)尤為明顯。據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌發(fā)病率已居我國(guó)女性惡性腫瘤的第2位，在沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)已經(jīng)成為發(fā)病率居首的女性惡性腫瘤。手術(shù)切除是治療乳腺癌的基本手段，但部分具有遠(yuǎn)處侵襲傾向，惡性程度高的乳腺癌患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，并且往往對(duì)術(shù)后放化療相對(duì)不敏感，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是這部分患者死亡的主要原因。因此，尋找可早期判斷轉(zhuǎn)移傾向的分子標(biāo)志物，乃至探索預(yù)防轉(zhuǎn)移的有效干預(yù)點(diǎn)顯得尤為迫切。眾多研究已經(jīng)表明腫瘤細(xì)胞從靜息狀態(tài)到轉(zhuǎn)移侵襲的激活，其所處的局部微環(huán)境發(fā)揮了決定性的作用。腫瘤間質(zhì)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，腫瘤間質(zhì)分泌的各種蛋白酶調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的功能狀態(tài)。本課題研究了激肽釋放酶相關(guān)肽6 (kallikrein-related peptidase 6，KLK6)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231遷移及侵襲運(yùn)動(dòng)的影響及其高表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)液及其試劑 細(xì)胞培養(yǎng)采用的胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品; DMEM培養(yǎng)基，D-Hanks緩沖液為美國(guó)Introvigen公司產(chǎn)品;胰蛋白酶為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)液由10%胎牛血清加入DMEM培養(yǎng)基中制備而成，每升培養(yǎng)液含青霉素1×105U及鏈霉素0.1 g。將胰蛋白酶(終濃度0.25%)溶于D-Hanks液后過濾除菌后用于細(xì)胞消化傳代。人激肽釋放KLK6重組蛋白購(gòu)于美國(guó)My-BioSource公司，溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株及乳腺癌組織收集 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞常規(guī)置于37℃含5%的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。收集2009年11月至2010年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院或廣西壯族自治區(qū)扶綏縣人民醫(yī)院手術(shù)切除的29例乳腺癌組織標(biāo)本，所有樣本均由病理診斷證實(shí)，且均為第1次手術(shù)治療，未經(jīng)放化療等其他治療。所收集組織標(biāo)本取得患者知情同意。

1.1.3 Transwell實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)板及細(xì)胞外基質(zhì) 12孔嵌入式細(xì)胞培養(yǎng)板(直徑10.5 mm，孔徑8 μm)為美國(guó)BD Biosciences公司產(chǎn)品。該培養(yǎng)板分為嵌入式的上小室與底部的下室，上小室與下室之間由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)膜相隔，8 μm的孔徑可容細(xì)胞通過。細(xì)胞外基質(zhì)購(gòu)于美國(guó)BD Biosciences公司，用于實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理并覆蓋PET膜。

1.1.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑 TRIzol與反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)于美國(guó)Invitrogen及Promeag公司，TaKaRa Ex Taq耐熱性DNA聚合酶為上海生工生物工程公司產(chǎn)品，引物委托上海生工生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 劃痕試驗(yàn) 細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至細(xì)胞相互融合鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，用無菌普通槍頭在培養(yǎng)皿均勻劃痕。無菌PBS緩沖液沖洗3次，換入新鮮培養(yǎng)液，處理組含40 nmol/L人KLK6重組蛋白，該濃度參考以往文獻(xiàn)［3］，對(duì)照組加入等量DMSO。拍照并觀察細(xì)胞于劃痕處的遷移情況，12 h及24 h后重新于同一視野重新拍照，運(yùn)用 Quantitative Wound Healing Image Analysis(德國(guó)Ibidi公司)在線分析軟件，以細(xì)胞覆蓋劃痕處的百分率定量評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移能力。隨機(jī)選取6處視野，通過比較兩組間均數(shù)評(píng)價(jià)其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 105的MDA-MB-231細(xì)胞重懸于10-3/L的無血清DMEM培養(yǎng)液中并接種于上小室，下室放置含10%血清的DMEM培養(yǎng)液。處理組上小室及下室含40 nmol/L人KLK6重組蛋白，處理組加入等量DMSO作為對(duì)照，每組6復(fù)孔。24 h后移去上小室，4%甲醛用于固定進(jìn)入下室的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色液染色，Quantity One軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)測(cè)量細(xì)胞數(shù)，計(jì)算24 h后通過PET膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)，定量分析處理組與對(duì)照組的細(xì)胞侵襲能力。

1.2.3 半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 按Trizol試劑盒說明提取29例乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。寡聚核苷酸引物: (KLK6，正義鏈，5'-GAAGCATAACCTTCGGCAAA-3';反義鏈，5'-GGGAAATCACCATCTGCTGT-3')，內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，正義鏈，5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';反義鏈，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3')。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)，72℃延伸4 min (聚合酶鏈反應(yīng)儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品)。反應(yīng)結(jié)束后，取聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物各5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)掃描。ImageJ軟件取得各樣本電泳條帶灰度值，利用各樣本KLK6/ GAPDH的比值半定量評(píng)估KLK6在各樣本中的表達(dá)高低。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)組間差異，F(xiàn)isher確切概率法用于檢驗(yàn)KLK6高表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLK6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移活動(dòng)的影響細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示在處理12 h后，處理組的細(xì)胞覆蓋面積為59.3%，而對(duì)照組為52.2%，處理組細(xì)胞覆蓋面積大于對(duì)照組，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在處理24 h后再次觀察，處理組的細(xì)胞覆蓋面積為84.4%，而對(duì)照組為64.7%(圖1)，表明人激肽釋放KLK6重組蛋白明顯促進(jìn)了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移活動(dòng)。

2.2 KLK6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響人KLK6重組蛋白同時(shí)加入處理組上小室與下室，對(duì)照組加入等量不含重組蛋白的DMSO。24 h后細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，處理組進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)平均為(589± 25)個(gè)，而對(duì)照組為(474±37)個(gè)(圖2)，處理組明顯多于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.3083，P＜0.05)，顯示激肽釋放KLK6增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力。

2.3 KLK6高表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示KLK6在29例乳腺癌原發(fā)灶組織中的灰度比值最大值為0.75，最小值為0.25，中位數(shù)為0.45，均數(shù)為0.44。以≥0.5定義為高表達(dá)，分析KLK6與諸臨床特征的關(guān)系。所有臨床分期均根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)于2003年頒布的乳腺癌TNM分期(第6版)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，KLK6高表達(dá)與年齡、T分期、M分期無關(guān)，與N分期，即淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(表1)。

表1 KLK6高表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 ［例(%)］

3 討論

KLK6屬于激肽釋放酶相關(guān)肽家族成員，該家族作為分泌糜蛋白酶和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶代表，在各種生理及病理?xiàng)l件下表達(dá)，包括各種人類腫瘤［4-6］。以往研究表明通過轉(zhuǎn)染技術(shù)使KLK6在小鼠角質(zhì)細(xì)胞株中異位表達(dá)，可破壞細(xì)胞間的黏附，加速細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其遷移、侵襲能力［7］。由于乳腺癌的預(yù)后與是否發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本課題研究了人重組KLK6蛋白在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231遷移及侵襲能力的影響，并研究了其在原發(fā)腫瘤中高表達(dá)的臨床意義。

劃痕試驗(yàn)是經(jīng)典的評(píng)估體外細(xì)胞遷移能力的方法，操作簡(jiǎn)便，而本研究進(jìn)一步通過計(jì)算12 h和24 h遷移細(xì)胞覆蓋劃痕處的百分率來定量評(píng)價(jià)其遷移活動(dòng)，比傳統(tǒng)僅僅通過肉眼觀察更為客觀可信。本研究還運(yùn)用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證KLK6在體外對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)是近年來發(fā)展起來的可用于評(píng)估細(xì)胞侵襲能力的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，由于在放置?xì)胞的上小室并沒有血清，具有侵襲傾向的MDA-MB-231細(xì)胞會(huì)向含有血清營(yíng)養(yǎng)成分的下室運(yùn)動(dòng)，與普通的遷移實(shí)驗(yàn)不同的是，分隔上下小室的PET膜預(yù)先包被了細(xì)胞外基質(zhì)，以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞若進(jìn)入下室，則先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶將基質(zhì)膠降解，方可通過PET膜，這與腫瘤細(xì)胞在體侵襲過程是一致的。結(jié)果顯示，KLK6不僅明顯促進(jìn)了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移，而且增加了MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。體外實(shí)驗(yàn)提示KLK6表達(dá)可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，為此進(jìn)一步研究了KLK6在乳腺癌組織的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，KLK6高表達(dá)組的病例其淋巴轉(zhuǎn)移率明顯高于低表達(dá)組，提示KLK6高表達(dá)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移傾向密切相關(guān)。Breitenbach等［8］報(bào)道了在化學(xué)藥物誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌中，KLK6的高表達(dá)出現(xiàn)在進(jìn)展期的腫瘤組織中，而在 Klucky等［7］的報(bào)道中，KLK6的異常高表達(dá)也與人類皮膚癌的臨床進(jìn)展有關(guān)。這些研究的結(jié)論與本研究的結(jié)果相一致，提示KLK6可能是一個(gè)通過增加乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力而促進(jìn)乳腺癌發(fā)展的腫瘤相關(guān)蛋白。一項(xiàng)新近的報(bào)道初步探討了KLK6作用于腫瘤微環(huán)境的具體通路及機(jī)制［3］，而通過將來更為深入的研究，KLK6不僅可能成為一個(gè)具有臨床診斷意義的蛋白分子，也有望成為一個(gè)潛在的乳腺癌治療的基因靶點(diǎn)。

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