高 越，楊 凌，鄔 蓉(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433)

尼莫地平片目前已在全國各大醫(yī)院廣泛使用，但尼莫地平親脂性高、水溶性小，口服不易吸收。制劑配方的合理與否，制劑工藝的好壞將直接影響尼莫地平片的生物利用度，影響尼莫地平的臨床療效。為克服現(xiàn)有劑型不足，進(jìn)一步改進(jìn)尼莫地平口服后的吸收性能，提高生物利用度，本課題在采用固體分散技術(shù)的基礎(chǔ)上研制了尼莫地平口崩片。該制劑不僅適用于吞咽困難的病人，而且對(duì)于在工作時(shí)不易獲得飲用水的患者提供了方便。本實(shí)驗(yàn)觀察了尼莫地平口崩片在健康志愿者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和相對(duì)生物利用度，并與其市售片進(jìn)行比較研究，旨在為口崩片的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

尼莫地平在體內(nèi)轉(zhuǎn)化后有多種代謝產(chǎn)物，且在人體血液或其它體液中的治療濃度較低。已經(jīng)有報(bào)道的檢測方法有GC，放免法及HPLC［1～4］，本試驗(yàn)采用簡單、快速、靈敏的HPLC法，測定了6名健康志愿受試者口服自制尼莫地平口崩片和市售普通片后的體內(nèi)藥時(shí)過程，進(jìn)行了人體藥代動(dòng)力學(xué)研究，并通過對(duì)計(jì)算參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，進(jìn)行了相對(duì)生物利用度的探討。

1 材料與儀器

尼莫地平口腔崩解片(自制);尼莫地平片(30 mg，中國北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司);尼群地平對(duì)照品(金壇喜琳醫(yī)藥原料有限公司);肝素鈉(江蘇常州千紅生化制藥有限公司);乙腈和甲醇(美國Fisher公司)均為色譜純;氫氧化鈉和乙酸乙酯(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)、磷酸氫二鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)均為分析純。

高效液相色譜儀:美國Agilent公司，包括Agi-lent 1100 HPLC，四元泵，在線脫氣機(jī)，高性能自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，DAD二級(jí)管陣列檢測器，配有Agilent ChemStation色譜工作站;XW-80型液體渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);高速離心機(jī)(ABBORT，美國);KUDOS SK2200H型超聲器(上?？茖?dǎo)超聲儀器公司);METYLER AE240型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司(梅特勒，美國);ORION MODEL828型pH計(jì)(美國奧立成ORION公司);水為二次蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血漿樣品的HPLC分析

2.1.1 血漿樣品預(yù)處理［5］精密量取血漿1 ml于10 ml磨口具塞離心管中，加入50 L濃度為2.0 μg/ ml的尼群地平內(nèi)標(biāo)溶液，5M NaOH 100 L和5 ml蛋白沉淀試劑(乙酸乙酯溶液)，渦漩混合3 min，以4 000 r/min離心10 min，吸取上清液至另一試管中，在50℃水浴鍋內(nèi)，經(jīng)氮?dú)饬鲹]干。加100 μl流動(dòng)相溶解殘留物，渦漩混合1 min后移至1.5 ml PP離心管內(nèi)，于12 000 r/min高速離心5 min，吸取上清液80 μl，置于進(jìn)樣瓶。取20 μl進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析。所有操作均避光進(jìn)行。

2.1.2 色譜系統(tǒng)條件 色譜柱:AgiLent ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為水(A)和甲醇(B)(磷酸氫二鉀調(diào)至 pH 9.07);梯度洗脫程序如下:0～20 min，63% ～63%B;20～24 min，63%～80%B;24～30 min，80%～80%B;進(jìn)樣前以流動(dòng)相梯度初始條件平衡10 min;流速1.0 ml/ min，檢測波長239 nm，進(jìn)樣量20 μl，柱溫25℃，運(yùn)行時(shí)間30 min。

2.2 分析方法的驗(yàn)證

2.2.1 分析方法特異性 取空白血漿100 μl除不加內(nèi)標(biāo)溶液并另外補(bǔ)加50 μl乙酸乙酯溶液，其余按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下方法操作，獲得空白血漿樣品;將一定濃度的尼莫地平對(duì)照溶液和內(nèi)標(biāo)-尼群地平溶液加入到1.5 ml塑料管中，50℃水浴通氮?dú)鈸]干溶劑，加入100 μl空白血漿，依上述樣品處理方法同法進(jìn)行樣品處理，獲得相應(yīng)的空白血漿添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液;取給藥后收集的血漿樣品，依同法進(jìn)行樣品處理，獲得實(shí)測血漿樣品溶液。在上述色譜條件下測得空白血漿、空白血漿添加標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)測血漿樣品溶液的典型圖譜見圖1所示。結(jié)果顯示保留時(shí)間分別為尼莫地平15.357 min，尼群地平12.416 min;相應(yīng)的理論塔板數(shù)均大于5 000，拖尾因子、分離度均符合測定要求，表明空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測成分和內(nèi)標(biāo)尼群地平的含量測定。

圖1 血漿中尼莫地平的HPLC圖A-空白血漿;B-空白血漿+內(nèi)標(biāo);C-空白血漿+內(nèi)標(biāo)+尼莫地平;D-實(shí)測血漿樣品

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍、檢測限與定量限

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備 精密稱取尼莫地平對(duì)照品9.41 mg，置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得尼莫地平對(duì)照品貯備液376.4 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋定容，制得7個(gè)濃度梯度的對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 內(nèi)標(biāo)尼群地平溶液的制備 精密稱取尼群地平對(duì)照品溶液10.02 mg置50 ml棕色容量瓶中制得濃度為200.4 μg/ml的對(duì)照品溶液，稀釋100倍制得濃度為2.004 μg/ml的尼群地平內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬血漿樣品溶液的制備 分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，置于1.5 ml塑料小離心管中，50℃水浴通氮?dú)鈸]干，加入100 μl空白血漿，后加入50 μl濃度為2.0 μg/ml的尼群地平甲醇內(nèi)標(biāo)溶液，5 M NaOH 50 μl和170 μl蛋白沉淀試劑(乙酸乙酯溶液)，渦旋混合30 s，于12 000 r/ min高速離心10 min，取上清，制得7個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品。

2.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取系列標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品，按"血漿樣品的處理方法"項(xiàng)下方法操作，制得7個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，進(jìn)行色譜分析，得血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù):R=0.003 1C+ 0.024 2，r=0.999 8，線性范圍為3.989 8～398.98 μg/ml。測得血漿中最低檢測限為0.214 μg/ml，最低定量限為0.537 μg/ml。

2.2.2.5 分析方法的精密度與準(zhǔn)確度 按血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法配制低、中、高3種不同濃度的尼莫地平的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按上述血漿樣品預(yù)處理步驟操作，測定日間和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。

表1 血漿中尼莫地平的日內(nèi)、日間精密度與準(zhǔn)確度(%)(n=5)

2.2.2.6 樣品穩(wěn)定性 依據(jù)“血漿樣品的分析方法”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)控樣品，平行制備5份，1份按血漿樣品處理項(xiàng)下方法立即提取分析;4份置－4℃貯存，于第1、2、3、4天取出后按血漿樣品處理后測定，觀察其變異情況，結(jié)果見表2。結(jié)果說明在－4℃放置4 d其變異＜15%，說明樣品在－4℃貯存穩(wěn)定性良好。

依據(jù)“血漿樣品的分析方法”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)控樣品，分別放置0、1、2、3、6、8、12 h后進(jìn)樣分析，觀察其變異情況，結(jié)果見表2。結(jié)果表明尼莫地平的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜15%，說明尼莫地平在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 血漿中尼莫地平的穩(wěn)定性

2.2.2.7 提取回收率 分別精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液170 μl，置1.5 ml塑料小離心管中，50℃ 水浴通氮揮干，加入100 μl空白血漿，按“血漿樣品的處理方法”項(xiàng)下操作，制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每濃度5個(gè)樣品。同時(shí)另取空白血漿100 μl，按“血漿樣品的處理方法”項(xiàng)下操作，獲得空白血漿樣品;精密吸取空白血漿樣品100 μl置1.5 ml塑料小離心管中，加尼群地平內(nèi)標(biāo)溶液50 μl和3個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液170 μl，取20 μl進(jìn)行HPLC分析，獲得相應(yīng)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)尼群地平的峰面積之比(A1/Ais)。將質(zhì)控樣品的峰面積之比與未經(jīng)提取處理的相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼莫地平與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A2/Ais)進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表3。

表3 HPLC法測定血漿尼莫地平的提取回收率結(jié)果

2.2.2.8 隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)量控制 以低、中、高3種濃度含尼莫地平的血漿質(zhì)控樣品與每個(gè)分析批的待測樣品同時(shí)測定，質(zhì)控樣品低、中、高3個(gè)濃度點(diǎn)測定結(jié)果偏差均小于10%。

本研究所建立的血漿樣品中尼莫地平的HPLC測定方法，簡便可靠，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾樣品峰，尼莫地平在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系;3個(gè)濃度梯度的相對(duì)回收率均在95.0% ～105.0%之間，日內(nèi)和日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于5.0%;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尼莫地平在 －4℃貯存及室溫放置12 h穩(wěn)定性良好。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明該方法符合生物樣品的分析要求，可以用于尼莫地平的藥動(dòng)學(xué)研究。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 健康志愿者試驗(yàn)設(shè)計(jì) 健康男性志愿者6名，年齡20～27歲，平均(23.0±0.7)歲;體重50～68 kg，平均(58.9±5.7)kg;身高169～179 cm，平均(173.3±4.2)cm。試驗(yàn)前經(jīng)體檢，心、肝、腎功能均為正常，受試者對(duì)試驗(yàn)過程及可能發(fā)生的不良反應(yīng)表示理解并簽約知情同意書。受試前2周內(nèi)停用一切藥物，用藥前禁食8 h，服藥后3 h統(tǒng)一進(jìn)食低脂肪低蛋白標(biāo)準(zhǔn)餐，受試期間禁止服用其它藥物及煙、酒、茶。采取隨機(jī)分成A、B兩組，A組于舌上給自制尼莫地平口崩片(劑量為60 mg)，B組口服尼莫地平普通片劑60 mg，同時(shí)用100 ml水送服。與服藥前和服藥后選定時(shí)間點(diǎn)用埋植于前上臂的留滯針采血3 ml，置于肝素化試管中，以4 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于-20℃的冰柜中保存待測。經(jīng)一周洗脫期后，兩組交換做自身對(duì)照。尼莫地平片劑及自制口崩片的取樣間隔為0、5、10、20、30、45 min;1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 h。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 非隔室模型分析法(統(tǒng)計(jì)矩法)［6］相應(yīng)的參數(shù)估算公式如下:

式中λ為藥時(shí)曲線末端相消除速率常數(shù)，tn和Cn分別為最后取血點(diǎn)時(shí)間和血漿藥物濃度。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax取相應(yīng)血漿樣品實(shí)測值。以市售普通片劑為對(duì)照制劑，進(jìn)行口腔崩解片相對(duì)生物利用度的計(jì)算。

相對(duì)生物利用度F=檢品的AUC/相同劑量市售片的AUC

表4 6名志愿者口服單劑量尼莫地平口崩片后體內(nèi)的血藥濃度

表5 6名志愿者口服單劑量尼莫地平市售片后體內(nèi)的血藥濃度

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用HPLC法進(jìn)行體內(nèi)尼莫地平血藥濃度的測定。健康志愿者單劑量口服尼莫地平自制口崩片和普通片劑后的體內(nèi)血藥濃度數(shù)據(jù)和血藥濃度-時(shí)間曲線圖分別見表4、表5和圖2。用梯形法計(jì)算曲線下面積AUC，照統(tǒng)計(jì)矩法［7］計(jì)算平均滯留時(shí)間(MRT)、平均吸收時(shí)間(MAT)、并計(jì)算相對(duì)生物利用度(F)，照藥動(dòng)學(xué)方法計(jì)算達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和達(dá)峰濃度(Cmax)等各種藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見表6、表7。

表6 6名志愿者口服尼莫地平口崩片后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

表7 6名志愿者口服尼莫地平市售片后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 尼莫地平口崩片和普通片給藥后健康志愿者體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線圖—■—口溶片;—▲—普通片

從以上結(jié)果可見，健康志愿者口含尼莫地平口崩片，血藥濃度藥-時(shí)曲線出現(xiàn)了明顯的速釋效果，藥物的達(dá)峰時(shí)間為(0.704 9±0.035)h;而服用普通片后的達(dá)峰時(shí)間為(1.331 7±0.123)h。普通片的達(dá)峰時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道的0.6～1.6 h相符。結(jié)果表明，口崩片的Tmax較普通片短，Cmax和AUC較普通片大，體內(nèi)吸收較普通片快，生物利用度也得到了提高，達(dá)到設(shè)計(jì)目的。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較 單劑量口服給藥口崩片與普通片，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)有明顯變化，從表6和表7中的AUC值，可算出自制尼莫地平口崩片相對(duì)于普通市售片的生物利用度為177.27%，尼莫地平口崩片的生物利用度顯著提高?？诒榔_(dá)峰時(shí)間Tmax比普通片達(dá)峰時(shí)間快0.63 h，口崩片的Cmax與市售片相比有極顯著性差異(P＜0.01)，而體內(nèi)平均滯留時(shí)間MRT有顯著性差異(P＜0.01)。說明口崩片速釋效果不影響藥物在體內(nèi)的治療效果。口崩片的吸收速率常數(shù)Ka值明顯高于市售片，說明口崩片吸收快，相應(yīng)的吸收速率常數(shù)較大，生物利用度提高，這種增加有益于臨床治療。這種生物藥劑學(xué)性質(zhì)的改變有益于血濃度提高和藥效作用延長。

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