鮑華燕，嚴 君，李 珂，劉 鵬(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京100050)

炎癥是多種疾病發(fā)生發(fā)展的基本病理過程，過度的炎癥反應會造成機體自身組織的損傷。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NFκB)是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，啟動和調(diào)節(jié)多種免疫和炎癥相關的基因轉(zhuǎn)錄［1］，受 NFκB調(diào)控的炎癥蛋白包括 MCP-1、ICAM-1、TNFα等［2］。

熱休克蛋白(heat-shock protein，HSPs)、高遷移率族蛋白(high-mobility group protein B，HMGB)1、S100蛋白均可以刺激胞內(nèi)炎癥反應，促進炎性因子釋放［3～5］。脂氧素、保護素、Resolvin是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類對于炎癥的轉(zhuǎn)歸具有重要調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)［6，7］。本實驗旨在研究 LXA4、ProD1和RvD1對NFκB活性的影響，為其在制備抗炎藥物中的應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清均購自美國Gibco公司，胰酶和LPS均購自美國Sigma公司，Glo-Max 96微孔板發(fā)光檢測儀和熒光素酶檢測試劑盒均購自美國Promega公司，NFκB p65抗體購自美國Cell Signal Technology公司，TNFα ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，HSP70購自加拿大StressMarq公司，HMGB1購自美國R＆D公司，S100A4購于北京義翹神州生物技術有限公司，LXA4、ProD1和RvD1均購自美國Cayman公司，細胞核蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，BCA蛋白定量試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 細胞培養(yǎng) 穩(wěn)定表達NFκB熒光素酶報告基因的中國倉鼠卵巢細胞(CHO，由本實驗室構建)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中加入10%新生牛血清，37℃、5%CO2。

1.3 細胞分組及處理 將生長良好的細胞用胰酶消化處理后，顯微鏡下對細胞進行計數(shù)并計算細胞密度，用細胞培養(yǎng)液稀釋細胞懸液置于96孔板內(nèi)，控制細胞數(shù)量約為1×104個/孔，置于細胞培養(yǎng)箱中約24 h待細胞貼壁后備用。

將細胞分為3大組:空白對照組，細胞培養(yǎng)板內(nèi)單純加入 DMEM培養(yǎng)液;LXA4/ProD1/RvD1+ LPS/HSP70/HMGB1/S100A4組，細胞培養(yǎng)板內(nèi)首先分別加入終濃度為100 nmol/L的LXA4/ProD1/ RvD1預處理CHO細胞30 min，然后分別加入終濃度為1 μg/ml的LPS/HSP70/HMGB1/S100A4對細胞進行刺激;單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4組，細胞培養(yǎng)板內(nèi)與上組細胞同一時間分別加入終濃度為1 μg/ml的LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激細胞。各組細胞經(jīng)過相應處理24 h后，測定細胞內(nèi)NFκB活性以及上清中TNFα的含量。

1.4 測定細胞內(nèi)NFκB活性 棄去細胞培養(yǎng)液，用生理鹽水將貼壁的CHO細胞清洗2次，加入裂解緩沖液反應約15 min，向裂解產(chǎn)物中加入熒光素酶檢測試劑，嚴格按照熒光素酶檢測試劑盒說明書操作，使用Glo-Max 96微孔板發(fā)光檢測儀評價細胞內(nèi)NFκB活性。

1.5 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中TNFα的含量移液槍移取細胞培養(yǎng)上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定上清液中TNFα的含量。

1.6 Western blot分析胞核中NFκB的含量 用細胞刮子將各組細胞刮下，嚴格按照細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取胞核、胞漿蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書對蛋白進行定量;蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)法印記于PVDF膜;用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗NFκB p65抗體4℃孵育過夜;次日用TBST洗滌后加入相應的辣根酶標記的二抗，室溫孵育1 h;洗滌后顯色。用Western blot印跡分析軟件(Gelpro3.2)計算各條帶光密度值，分析蛋白表達情況。

1.7 統(tǒng)計分析 實驗結果用均值±標準誤(Mean ±SE)表示。使用SPSS 13.0專業(yè)統(tǒng)計軟件，經(jīng)參數(shù)或者非參數(shù)方差檢驗，經(jīng)比較P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01認為有明顯統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 LPS/HSP70/HMGB1/S100A4顯著上調(diào)細胞NFκB活性 各組細胞分別經(jīng)相應的處理后，測定其NFκB的活性，對照組細胞內(nèi)NFκB的活性維持在較低的水平，經(jīng)LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激后，細胞內(nèi)NFκB活性顯著升高(P＜0.05，圖1)。但四種物質(zhì)激活NFκB活性的強度不盡相同，其中 LPS的激活作用最強，HSP70作用次之，HMGB1和S100A4對NFκB活性的刺激作用相當。

2.2 LPS/HSP70/HMGB1/S100A4顯著增加胞外TNFα的含量 與對照組相比，細胞經(jīng)LPS/HSP70/ HMGB1/S100A4處理后，分泌到胞外的TNFα的量顯著增加(P＜0.05，圖2)。四種物質(zhì)中LPS刺激細胞分泌TNFα的作用最強，HMGB1作用最弱，HSP70和S100A4作用相當。

圖2 LPS、HSP70、HMGB1、S100A4對細胞分泌TNFα的影響LPS/HSP70/HMGB1/S100A4顯著增加胞外TNFα的含量，獨立實驗重復4次。

2.3 LXA4/ProD1/RvD1下調(diào)細胞NFκB活性 與單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激的細胞相比，加入LXA4/ProD1/RvD1預處理的細胞，其NFκB的活性顯著被抑制(P＜0.05，圖3)，不同的物質(zhì)對NFκB活性的抑制程度存在差異，與對照組相比，LXA4抑制NFκB活化的作用最為顯著(P＜0.01)。

2.4 LXA4/ProD1/RvD1顯著減少胞外TNFα的含量 與單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激的細胞相比，加入LXA4/ProD1/RvD1預處理的細胞，分泌到胞外的TNFα的量顯著減少(P＜0.05，圖4)，但LXA4、ProD1或RvD1對TNFα分泌的抑制程度存在一定的差異。

2.5 LXA4/ProD1/RvD1減少NFκB的入核 與單純LPS/HSP70/HMGB1/S100A4刺激的細胞相比，加入LXA4/ProD1/RvD1預處理的大部分組別細胞，其胞核內(nèi)NFκB p65的含量明顯降低(圖5)。但其中，ProD1、RvD1并不能抑制由HMGB1和S100引起的NFκB的入核。

圖3 LXA4、ProD1、RvD1顯著抑制NFκB活性A-LXA4處理組;B-ProD1處理組;C-RvD1處理組，獨立實驗重復4次。

圖4 LXA4、ProD1、RvD1顯著減少上清中TNFα含量A-LXA4處理組;B-ProD1處理組;C-RvD1處理組，獨立實驗重復4次。

圖5 LXA4/ProD1/RvD1對NFκB入核的影響A-LXA4處理組;B-ProD1處理組;C-RvD1處理組，獨立實驗重復4次。HT?

3 討論

炎癥是機體抵抗病原入侵、修復組織細胞損傷的重要防御機制之一，若炎癥反應持續(xù)維持在較高的水平會對機體造成損傷，甚至導致組織的纖維化。炎癥的轉(zhuǎn)歸是指浸潤在組織局部的白細胞及細胞碎片等被從炎癥部位清除，使組織重新恢復穩(wěn)態(tài)［8］。炎癥的轉(zhuǎn)歸并不是炎癥反應的被動終止，而是一個主動的代謝過程［9，10］。一些脂質(zhì)小分子在炎癥的轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的作用，脂氧素、保護素、Resolvin即是其中重要的一族，在機體內(nèi)，它們主要由ω-3不飽和脂肪酸在5-脂氧合酶、15-脂氧合酶等酶類的催化下經(jīng)過跨細胞途徑生成［11～13］。

NFκB是一種與炎癥反應密切相關的核轉(zhuǎn)錄因子，被NFκB激活的細胞因子，如IL-1β、TNFα可以直接進一步引起NFκB的活化，從而形成一個正調(diào)控增加炎癥應答和延長慢性炎癥的持續(xù)時間［14］。本實驗結果表明，用LXA4、ProD1、RvD1對細胞進行預處理，能夠不同程度抑制胞內(nèi)NFκB的活性，減少分泌到胞外的TNFα的量，其對NFκB活性的抑制作用與其抑制胞漿NFκB的入核有關，這可能是這幾個脂質(zhì)介質(zhì)具有促進炎癥轉(zhuǎn)歸作用的重要原因之一。Wang等人在2011年的研究發(fā)現(xiàn)［15］，脂氧素同系物ATL能夠抑制胞漿IκB的降解，阻斷NFκB的入核，抑制NFκB、AP-1與DNA的結合，從而顯著抑制TNFα mRNA的表達，其抑制作用接近100%。本實驗中，LXA4抑制由LPS、HSP70引起的NFκB活化的作用最為顯著，LXA4使細胞在LPS、HSP70刺激下的NFκB活性降低到接近正常細胞水平，因此推測LXA4對NFκB的激活具有強抑制作用的機制可能也與上述報道一致，這進一步說明LXA4等脂質(zhì)小分子具有被進一步研究和開發(fā)的潛力。另外，本研究發(fā)現(xiàn)LXA4、ProD1、RvD1各自對細胞活化NFκB和產(chǎn)生TNFα的抑制作用強度存在較大差異，造成這種差異的內(nèi)在機制還有待更加深入的研究。

NFκB作為炎癥反應中的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，從理論上說，如果能特異性地拮抗其活性，就可以起到高效的抗炎免疫效果。目前多種傳統(tǒng)抗炎藥，如糖皮質(zhì)激素、阿司匹林、水楊酸鈉等，就是通過多種途徑抑制NFκB等轉(zhuǎn)錄因子的活性，有效降低相關炎癥介質(zhì)的表達和釋放。目前已有研究證明，LXA4、ProD1、RvD1具有抗炎和促炎癥轉(zhuǎn)歸的雙重作用［16］，雖然這3種脂質(zhì)介質(zhì)發(fā)揮作用的具體分子機制和信號途徑還需要進一步的深入研究，但是本實驗為治療一些炎性疾病提供了新的思路，對于研究開發(fā)新型的小分子抗炎藥具有重要的參考價值。

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