楊志勇，王占良，張建麗，張亦農(nóng)

（國(guó)家體育總局中國(guó)反興奮劑中心，北京 100029）

麻醉劑類藥物主要包含嗎啡類藥物、可卡因類藥物和大麻，被世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）列入禁藥名單[1]。臨床上嗎啡類藥物屬阿片類生物堿，為阿片受體激動(dòng)劑，激動(dòng)中樞神經(jīng)阿片受體而產(chǎn)生強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛作用，主要經(jīng)肝臟代謝，在肝內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合，少量為游離型；代謝物主要包含可待因、嗎啡、雙氫可待因、6－乙酰嗎啡、羥考酮等，經(jīng)腎臟排泄，尿樣中主要為結(jié)合型代謝物?？煽ㄒ騽e名古柯堿，是人類發(fā)現(xiàn)的第一種具有局麻作用的天然生物堿，主要經(jīng)肝臟代謝為苯甲酰愛(ài)康寧，在肝內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合，經(jīng)腎臟排泄，尿樣中主要為結(jié)合型代謝物。大麻主要成分為四氫大麻酚、大麻二酚和大麻酚，主要經(jīng)肝臟代謝為四氫大麻酚酸，在肝內(nèi)與葡萄糖醛酸結(jié)合，經(jīng)腎臟排泄，尿中主要為結(jié)合型代謝物，四氫大麻酚酸為WADA鑒別運(yùn)動(dòng)員是否服用大麻的唯一目標(biāo)定量物質(zhì)[1]。

以上的7種尿樣中麻醉劑常見(jiàn)代謝物質(zhì)均為葡萄糖醛酸結(jié)合型代謝物，常規(guī)分析方法都需要酶解反應(yīng)后，去除葡萄糖醛酸分析；該7種物質(zhì)的酸堿性差異很大，可待因、嗎啡、雙氫可待因、6－乙酰嗎啡和羥考酮為堿性，苯甲酰愛(ài)康寧和四氫大麻酚酸為酸性，液液提取需要酸、堿性分別提取，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；提取溶劑也有差別，苯甲酰愛(ài)康寧需要使用特殊的混合溶劑（V（氯仿）∶V（異丙醇）＝9∶1）；而嗎啡的液液提取回收率很差。固相萃取技術(shù)的出現(xiàn)解決以上的液液提取的不足，樣品經(jīng)酶解后直接經(jīng)過(guò)Oasis HLB小柱純化，樣品回收率和檢測(cè)限均顯著提高。

目前，對(duì)此類藥物的定性分析主要采用GC/MS、LC/MS 方 法[2－20]。本 實(shí) 驗(yàn)基 于 GC/MS技術(shù)和固相萃取簡(jiǎn)單快速的樣品前處理過(guò)程，建立一個(gè)快速準(zhǔn)確檢測(cè)尿樣中的麻醉劑類藥物代謝物的方法，旨在快速檢測(cè)尿樣中7個(gè)常見(jiàn)代謝物：可待因、嗎啡、四氫大麻酚酸、雙氫可待因、苯甲酰愛(ài)康寧、6－乙酰嗎啡、羥考酮（其結(jié)構(gòu)分別示于圖1）。

圖1 可待因、雙氫可待因、四氫大麻酚酸、苯甲酰愛(ài)康寧、6－乙酰嗎啡、嗎啡、羥考酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Codeine，Dihydrocodeine，Carboxy－THC，Benzoylecgonine，6－acetylmorphine，Morphine，and Oxycodone

1.1 儀器和試劑

7890GC－5975MS氣相色譜－質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；色譜柱 HP－5MS柱：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；低溫恒溫循環(huán)液浴兩用槽：杭州雪中炭技術(shù)公司產(chǎn)品；Legend T低速離心機(jī)：美國(guó) Thermo公司產(chǎn)品；Dri－block DB－3D 氮?dú)獯蹈裳b置：美國(guó)Techne公司產(chǎn)品；沃特斯20孔固相萃取裝置和HLB Oasis 3cc 60mg反相固相萃取柱：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

可待因、嗎啡、雙氫可待因、苯甲酰愛(ài)康寧、6－乙酰嗎啡和羥考酮從澳大利亞購(gòu)買，四氫大麻酚酸為實(shí)驗(yàn)室間贈(zèng)送。分別精密稱取配制成1g/L的甲醇溶液（四氫大麻酚酸為0.1g/L）；β－葡萄糖醛酸甙酶和甲基睪酮（內(nèi)標(biāo)，20mg/L）購(gòu)自Sigma公司；甲醇為色譜純；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀均為分析純。0.1mol/L磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀磷酸鹽緩沖液pH 6.9；三甲基硅基三氟乙酰胺：MSTFA，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；三甲基碘硅烷：TMSI，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；二硫代赤糖蘚醇：分析純，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，以V（MSTFA）∶V（TMSI）∶V（二硫代赤糖蘚醇）＝1 000∶3∶1的溶劑為衍生化試劑。

1.2 樣品前處理

尿樣2mL，20μL內(nèi)標(biāo)（甲基睪酮，20mg/L）甲醇溶液，加入1mL磷酸緩沖液，50μLβ－葡萄糖醛酸甙酶（2 500unit），55℃恒溫水浴中靜置120min，取出樣品冷卻至室溫，上樣 HLB Oasis 3cc 60mg反相固相萃取柱（依次用3mL甲醇，3mL水活化），3mL20%甲醇水溶液淋洗后，采用3mL甲醇洗脫，60℃下用氮?dú)獯蹈?，加入衍生化試?0μL，振蕩3s后轉(zhuǎn)移入小瓶中，加蓋，于70℃反應(yīng)30min，進(jìn)樣2μL，進(jìn)行GC/MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確量取7種藥物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度列于表1。取10μL該溶液，空白尿樣2mL，加入20μL內(nèi)標(biāo)，按1.2步驟開(kāi)始分析，結(jié)果示于圖2。

表1 化合物1～7的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of compounds 1—7

1.4 儀器條件

色譜柱 HP－5MS柱（25m ×0.2mm×0.33 μm）；進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：300℃；采用恒壓模式，柱壓：75kPa；分流比10∶1；進(jìn)樣2 μL；程序升溫：180℃保持0min，以10℃/min升到220℃，以5℃/min升到260℃，以10℃/min升到300℃，保持10min；質(zhì)譜離子源為EI源，離子源溫度230℃，源電壓70eV；采集模式：SIM方式。溶劑延遲時(shí)間6min?；衔锏倪x擇離子列于表1。

1.5 方法靈敏度

量取1.3中的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋成1mg/L的溶液，量取此溶液加入2mL的空白尿樣中，配制成含量為2、5和10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)添加尿樣，采用1.2的樣品處理方法，進(jìn)樣分析，按照S/N＝3的要求，計(jì)算檢測(cè)限，檢測(cè)限圖示于圖3。

1.6 方法的重現(xiàn)性

高、中、低3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入空白尿樣2mL，每個(gè)濃度平行測(cè)定6份，按照1.2的前處理方法進(jìn)行分析。內(nèi)標(biāo)校正后與平行處理的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加的空白質(zhì)控樣品比對(duì)計(jì)算回收率，結(jié)果列于表2。

圖2 空白樣本添加標(biāo)準(zhǔn)品后的選擇離子圖和化合物1～7的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of compounds 1—7and spectra of blank urine spiked quality control solution

圖3 7種常見(jiàn)代謝物的檢測(cè)限圖Fig.3 Detection limit spectrum of 7kinds of narcotic agents

表2 化合物1～7的相對(duì)回收率Table 2 The relative recovery of compounds 1—7

2 結(jié)果與討論

2.1 譜圖

從圖2的GC/MS選擇離子圖中可以看到，空白尿樣中添加的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)具有良好的分離度，各化合物的保留時(shí)間與內(nèi)標(biāo)位置適中，滿足色譜分離的要求?；衔?～7的質(zhì)譜結(jié)果中均含有衍生化反應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰，化合物1、2、4的準(zhǔn)分子離子峰為單個(gè)TMS的分子離子，其余的則為2TMS的分子離子，衍生化反應(yīng)主要發(fā)生在化合物的羥基、酮基和羰基?；衔?、2、5～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似，具有相似的母核，質(zhì)譜圖中均具有[M－CH3]＋的碎片，而且強(qiáng)度比較一致，在10%左右，且具有相似的碎片離子 m/z 178、m/z 196、m/z 234或 m/z 236等。化合物3的質(zhì)譜圖中含有[M－O＝COTMS]＋碎片，即m/z371，同時(shí)也是基峰；m/z473為[M－CH3]＋的碎片?；衔?的的分子離子峰為m/z361，主要碎片m/z240為連接兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的酯鍵斷裂形成，即[M－C6H5COO]＋碎片。

2.2 檢測(cè)限

化合物的檢測(cè)限結(jié)果示于圖3，從圖3可以看出，按照S/N＝3計(jì)算化合物1～7的檢測(cè)限均為5mg/L，以上結(jié)果滿足了尿樣檢測(cè)的需要。

2.3 回收率和重現(xiàn)性

在高、中、低3種濃度的回收率實(shí)驗(yàn)中，化合物1～7的回收率結(jié)果分布在75%～123%之間，基本滿足了定性檢測(cè)要求。

2.4 應(yīng)用舉例

本方法已成功應(yīng)用于能力驗(yàn)證《尿中常見(jiàn)毒物的測(cè)定》，成功檢出尿樣中的可待因和嗎啡，其選擇離子流圖示于圖4；另外該方法作為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法用于檢測(cè)社會(huì)送檢的非運(yùn)動(dòng)員尿樣。

2.5 討論

固相萃取技術(shù)應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，其優(yōu)勢(shì)是解決了液體樣本中難于液液提取或濃度很低不易富集等困擾，一次將目標(biāo)化合物全部提取，簡(jiǎn)單而又省時(shí)，提高了檢測(cè)靈敏度和重現(xiàn)性；但是目前還沒(méi)有應(yīng)用到興奮劑尿樣的常規(guī)檢測(cè)中，它還只是作為確證方法應(yīng)用于可疑樣品的確證分析。隨著該方法的成熟和成本降低，將固相萃取技術(shù)應(yīng)用到興奮劑尿樣常規(guī)檢測(cè)已是大勢(shì)所趨。

對(duì)于大部分實(shí)驗(yàn)室，氣質(zhì)聯(lián)用儀器為基本配置，因此，結(jié)合固相萃取技術(shù)的本方法具有更廣泛的適用性和實(shí)用性。

圖4 一例陽(yáng)性樣品的選擇離子流圖Fig.4 Multiple reaction monitoring spectra of a positive sample

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