李學(xué)博，莫耀南，周海梅，李 樸，馬錦琦，萬立華，王清山

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)與生物醫(yī)學(xué)信息研究室，重慶 400016；2.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003；3.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 401147）

在法醫(yī)學(xué)檢案過程中常遇到嚴(yán)重腐敗甚至白骨化的尸體，難以獲得合適的用于毒物分析的體液和組織樣本，此時(shí)嗜尸性昆蟲的幼蟲和蛹可以作為 可 靠 的 檢材[1－2]。1980 年 Beyer等[3]首次利用孳生在骸骨上的蛆蟲樣本成功檢測(cè)出了苯巴比妥藥物，隨后的研究表明多種藥（毒）物可以通過昆蟲樣本進(jìn)行檢測(cè)，Kharbouche等[4]利用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）技術(shù)從絲光綠蠅體內(nèi)成功測(cè)定了可待因，Wood等[5]利用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS/MS）技術(shù)從紅頭麗蠅幼蟲體內(nèi)成功檢測(cè)了10種苯二氮卓類藥物，Gosselin等[6]利用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）方法成功檢測(cè)了絲光綠蠅幼蟲體內(nèi)的美沙酮，Roeterdink等[7]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP－MS）技術(shù)分析了麗蠅幼蟲體內(nèi)射擊殘留物成分，此外，也有利用氣相色譜－質(zhì)譜（GC/MS）技術(shù)成功定量檢測(cè)蠅蛆體內(nèi)苯丙胺類毒品及馬拉硫磷的報(bào)道[8－10]，現(xiàn)代化檢測(cè)儀器設(shè)備的使用使定量測(cè)定單個(gè)幼蟲及蛹樣本的藥（毒）物水平成為可能[5－6]，甚至羽化后的空蛹?xì)ず团判刮镆部梢詸z測(cè)到部分毒物成分[11－12]，即使在軟組織中不能檢測(cè)到的毒物，仍可以通過蠅類幼蟲測(cè)得[13]。更為有利的是，以昆蟲為檢材進(jìn)行藥（毒）物分析時(shí)，分析儀器還不會(huì)受到尸體分解產(chǎn)物，如尸堿的影響[2，14－15]。

氯氮平（clozapine，CLP）是臨床最常用的抗精神病藥物之一，也是患者意外過量服用中毒死亡和自殺案件中常見的藥物。本研究通過建立固相微萃取氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（SPME－GCMS）的檢測(cè)方法，對(duì)取食含有不同濃度CLP培養(yǎng)基質(zhì)上的大頭金蠅幼蟲和蛹進(jìn)行定量檢測(cè)，旨在為同類中毒死亡案件的分析檢驗(yàn)提供相關(guān)借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6890－5973N氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent科技有限公司產(chǎn)品；NIST98色譜工作站；固相微萃取儀（SPME）及100μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品。

氯氮平（clozapine，CLP）標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定中心提供；洛沙平（loxapine）標(biāo)準(zhǔn)品：內(nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定中心提供；氯化鈉、氫氧化鈉、甲醇：均為分析純。

1.2 儀器條件及溶液配制

1.2.1 色譜－質(zhì)譜條件 色譜柱：HP－5MS（30 m×0.25mm×0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱；柱流量1.0mL/min；柱溫設(shè)定：初溫160℃，以40℃/min升溫至260℃，再以5℃/min升溫至280℃；進(jìn)樣口溫度：260℃；載氣：高純氦氣；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；GC/MS接口溫度：280℃；EI源（70eV），電子倍增器電壓1 106V。

1.2.2 溶液配制 精密稱取CLP標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，添加50mL甲醇溶解稀釋，得100mg/L CLP標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，同法配制100mg/L洛沙平儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱避光保存。精密量取CLP標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，加甲醇分別配置成50、100、500、1 000、5 000、10 000、50 000μg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。同法配制1 500μg/L濃度的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3 大頭金蠅培養(yǎng)

供試大頭金蠅為野外捕獲，經(jīng)鑒定種屬后在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)獲得，在蠅籠內(nèi)以紅糖、奶粉飼養(yǎng)，產(chǎn)卵高峰期以新鮮豬肝誘其產(chǎn)卵。取肝組織4份，400g/份，分別添加2mg、4mg及8mg的CLP水溶液后攪碎混勻并盛裝在500mL燒杯內(nèi)，分別編號(hào)C1、C2、C3，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組C0組。將卵塊取出后按照400粒/份分別接種至以上含有不同濃度CLP的培養(yǎng)基上，將燒杯放至30cm×40cm×30cm的培養(yǎng)盒內(nèi)，培養(yǎng)盒底層鋪有2cm消毒細(xì)沙，上口覆蓋固定細(xì)孔紗網(wǎng)。置于實(shí)驗(yàn)溫度（25±0.2）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光周期L∶D＝14∶10下培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[4]方法，分別在大頭金蠅卵孵化后的52、76、100、124h及離食前期和后期取幼蟲各50只，待幼蟲化蛹后，取蛹樣本50只，將以上樣本置于－20℃冰箱凍死，保存?zhèn)錂z。

1.4 樣本處理與測(cè)定

取不同時(shí)期的大頭金蠅幼蟲及蛹的樣本，每次分析隨機(jī)取10只，稱重后按照參考文獻(xiàn)中的方法[4，16]，先后用去離子水反復(fù)沖洗，去除體表粘附的食物組織，用濾紙吸干體表殘留液體，在樣本中加入200μL內(nèi)標(biāo)工作液，添加甲醇4g勻漿，置于60℃水浴中加熱平衡10min，離心，取上清液2mL至4mL樣品瓶，加入1.0g NaCl飽和溶液，添加1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為9，振蕩20s。再將樣品瓶置于40℃水浴中加熱平衡10min，然后將萃取頭浸入樣品萃取30min。取出萃取頭置于雙蒸水中振洗20s，然后置于50%甲醇中振洗10s，取出后揮干并插入GC/MS進(jìn)樣口解析90s。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜圖

取含有內(nèi)標(biāo)的CLP標(biāo)準(zhǔn)工作液，以掃描方式進(jìn)樣及選擇離子（SIM）方式檢測(cè)，其總子流圖示于圖1。待CLP與內(nèi)標(biāo)完全分離，二者的保留時(shí)間分別為6.97min及10.01min，CLP選擇離子為：m/z 243、256、192、245，洛沙平選擇離子為：m/z257、83、70、193，如圖2、圖3所示，未見其他干擾成分。

圖1 GC/MS方式檢測(cè)樣本內(nèi)的總離子色譜圖Fig.1 TIC of samples analyzed by GC/MS

2.2 檢測(cè)限與標(biāo)準(zhǔn)曲線

取孵化后100h的C0組大頭金蠅幼蟲10只/份，按照預(yù)處理方法洗凈后分別添加一定量的CLP，制作分別含有 CLP 5、10、50、100、500、1 000、5 000μg/L的樣品（均含內(nèi)標(biāo)500μg/L），以選擇離子方式進(jìn)樣，測(cè)定CLP檢測(cè)限并計(jì)算信噪比，根據(jù)峰面積比對(duì)濃度比（CLP對(duì)內(nèi)標(biāo)）作線性回歸。結(jié)果顯示CLP的檢測(cè)限為0.1 μg/L（信噪比＞3），在5～5 000ng/mg范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：y＝0.039 9x－0.607 3，r＝0.999 8（n＝7），示于圖4。

圖2 氯氮平的總離子質(zhì)譜圖Fig.2 Toltal ion mass－spectrograms of CLP

圖3 洛沙平的總離子質(zhì)譜圖Fig.3 Toltal ion mass－spectrograms of loxapine

圖4 氯氮平的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.4 Standard curve of CLP

2.3 回收率與精密度

取孵化后100h的C0組大頭金蠅幼蟲10只/份，按照預(yù)處理方法洗凈后分別添加一定量的CLP，分別制作含有CLP 100、500、1 000μg/L樣品（均含內(nèi)標(biāo)500μg/L），按1.4樣品預(yù)處理步驟操作后分析測(cè)定，1日內(nèi)重復(fù)分析測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3日，按照上述回歸方程計(jì)算各濃度的相對(duì)回收率均值，并得日內(nèi)及日間精密度均值，列于表1。

2.4 大頭金蠅樣品內(nèi)CLP水平測(cè)定

按上述樣品處理方法及檢測(cè)條件，對(duì)生長在含有不同濃度CLP培養(yǎng)基質(zhì)上的大頭金蠅不同時(shí)期的幼蟲和蛹進(jìn)行分析測(cè)定，成功定量檢測(cè)出了樣品中的CLP。實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)的樣本經(jīng)去離子水和甲醇反復(fù)沖洗后，可去除體表食物成分中CLP對(duì)檢測(cè)的影響[17]，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

表1 SPME－GC/MS法在大頭金蠅幼蟲樣本內(nèi)的準(zhǔn)確度及精密度Table 1 Accuracy and precision of clozapine from larvae of Chrysomya megacephala by SPME－GC/MS

檢測(cè)結(jié)果列于表2。由表2可看出，在取食期、離食期的幼蟲和蛹內(nèi)均檢測(cè)到了CLP，其中76h、100h及124h的取食期幼蟲各實(shí)驗(yàn)組樣本間CLP水平差異顯著（P＜0.05）。大頭金蠅樣本內(nèi)CLP水平與取食時(shí)間有關(guān)，在幼蟲發(fā)育的早期CLP水平較低，隨著取食時(shí)間的延長而增長，與上一次檢測(cè)結(jié)果相比，取食76h和124 h的幼蟲變化顯著（P＜0.01），這可能與CLP在幼蟲體內(nèi)不斷蓄積有關(guān)。在離食期CLP水平又大大降低（P＜0.01），這是由于此時(shí)CLP的排泄大于攝入所致，蛹期僅檢測(cè)到極微量的CLP，與相關(guān)研究報(bào)道一致[12，18]。通常情況下，由于受到代謝的影響，組織中的藥物濃度明顯高于昆蟲樣本[19]。

表2 不同時(shí)期的大頭金蠅幼蟲及蛹樣本CLP的濃度（μg/g，±s）Table 2 Concentration of CLP in samples of larvae and pupae in different time（μg/g，±s）

表2 不同時(shí)期的大頭金蠅幼蟲及蛹樣本CLP的濃度（μg/g，±s）Table 2 Concentration of CLP in samples of larvae and pupae in different time（μg/g，±s）

分組 幼蟲52h 幼蟲76h 幼蟲100h 幼蟲124h 離食前期幼蟲 離食后期幼蟲 蛹C1 1.9±0.33 2.38±0.81 3.23±1.22 4.27±1.23 2.02±0.67 1.24±0.37 0.09±0.02 C2 2.33±0.38 4.12±1.56 6.22±1.55 8.25±3.58 3.84±1.26 1.65±0.43 0.15±0.06 C3 3.28±0.65 6.56±2.34 9.61±2.67 12.33±4.224.55±1.85 1.88±0.76 0.18±0.05

3 結(jié) 論

SPME技術(shù)是一種新型的樣品前處理技術(shù)，它利用待測(cè)物對(duì)活性固體表面的吸附力而達(dá)到分離富集的目的，因萃取不破壞樣品本身的性質(zhì)，而又具有簡(jiǎn)單、快速、環(huán)保、靈敏度和精密度高的優(yōu)點(diǎn)，SPME－GC/MS聯(lián)用的方法已被廣泛應(yīng)用于包括體液、組織等多種生物樣品中化學(xué)成分的檢測(cè)。本研究應(yīng)用SPME－GC/MS聯(lián)用的方法，準(zhǔn)確定性、定量檢測(cè)大頭金蠅不同時(shí)期的幼蟲及蛹樣本的CLP濃度，檢出限為0.1μg/L，在5～5 000μg/L范圍內(nèi)線性良好，不同濃度的回收率在93%～104%間，日內(nèi)及日間RSD均小于8%。

該方法結(jié)果可靠，簡(jiǎn)便快捷，精密度好，可用于此類中毒案件的法醫(yī)學(xué)分析測(cè)定，昆蟲樣本可作為替代或補(bǔ)充樣本，與腐敗組織及體液相比，昆蟲體內(nèi)的藥（毒）物保存時(shí)間更穩(wěn)定持久[20－21]，在難以獲得合適的組織體液樣本及尸體嚴(yán)重腐敗，影響儀器檢測(cè)效果的案件中有重要價(jià)值。另一方面，對(duì)疑為謀殺后偽裝CLP中毒，有蠅蛆孳生的案件，可檢測(cè)尸體特殊部位昆蟲樣本獲得間接證據(jù)，為案件分析提供參考依據(jù)。本研究顯示，大頭金蠅樣本內(nèi)CLP水平與食物內(nèi)的含量具有相關(guān)性，不同階段大頭金蠅樣本CLP含量隨時(shí)間的變化而改變，取食階段的幼蟲體內(nèi)含量可不斷蓄積到較高水平，到達(dá)離食期后由于幼蟲停止取食加上正常的排泄導(dǎo)致體內(nèi)CLP水平急劇下降。部分研究[4，12，22]也表明，藥（毒）物在昆蟲體內(nèi)存在明顯的蓄積及分解代謝活動(dòng)，可引起體內(nèi)藥物水平及成分的明顯改變，因此今后的研究還要加強(qiáng)代謝物的檢測(cè)，以獲得更為精確的結(jié)果。

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