杜思邈， 潘一峰， 張 寧*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203;2.上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司，上海200051)

芪麝丸由黃芪、川芎、青風(fēng)藤、粉防己等多味藥組成，具有益氣化瘀、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋止痛的作用。黃芪［1］為方中君藥，其黃酮類成分具有改善血液循環(huán)，提高免疫力的作用，其中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷為其主要有效成分。川芎［2］同樣為本方的君藥，其中萜類成分 (如洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A)為其辛香行散，溫通血脈作用的主要有效成分。粉防己［3］、青風(fēng)藤［4］為方中佐藥，其中生物堿類成分(如粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿)為其祛風(fēng)除濕，利水消腫止痛作用的主要有效成分。文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)上述9種成分的定量測(cè)定方法有薄層掃描法［5］、紫外分光光度法［6］、旋光法［7］、高效液相色譜法［8-11］、非水毛細(xì)管電泳法［12］等。

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC梯度洗脫內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定制劑中的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿9種成分，方法簡(jiǎn)便，精確度高，對(duì)于采用多成分監(jiān)控復(fù)方制劑的質(zhì)量具有參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀。甲醇 (色譜純，Spectrum公司);娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán)，批號(hào)20110303);其余試劑均為分析純。芪麝丸 (上海黃海制藥有限公司，批號(hào)分別為100601、100602、101101);洋川芎內(nèi)酯 I對(duì)照品 (自制，油狀物，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、IR、UV、MS鑒定為洋川芎內(nèi)酯I，純度為98%);毛蕊異黃酮對(duì)照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)201104);毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)201101，純度≥98%);芒柄花素對(duì)照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)201005，純度≥98%);芒柄花素苷對(duì)照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)201006，純度≥98%);洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)201103，純度≥98%);粉防己堿對(duì)照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)711-9304，含量測(cè)定用);防己諾林堿對(duì)照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)0793-9203，含量測(cè)定用);青藤堿對(duì)照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)0774-200206，含量測(cè)定用);異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110738-200511，含量測(cè)定用)。

2 色譜條件

Kromasil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫;體積流量0.8 mL/min;測(cè)定波長262 nm;柱溫30℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode

在乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫的色譜條件下，進(jìn)行了內(nèi)標(biāo)物的篩選，嘗試了龍膽苦苷、芍藥苷、異補(bǔ)骨脂素等多種物質(zhì)，其中異補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間較合適，且與其他9種物質(zhì)在此條件下均可達(dá)到與基線分離，峰形對(duì)稱，又因本制劑樣品中不含異補(bǔ)骨脂素，故選定異補(bǔ)骨脂素為HPLC法的內(nèi)標(biāo)物。

3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 供試品溶液的制備 本品研細(xì)，取1g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲50 min，放冷后加甲醇至刻度;另取10 mL量瓶，精密加入內(nèi)標(biāo)異補(bǔ)骨脂素溶液 (0.1 mg/mL)1 mL，再加入芪麝丸樣品溶液至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。見圖1。

圖1 加內(nèi)標(biāo)的芪麝丸樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram ofQishePillsamplewith internal standard

3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒質(zhì)量的異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含0.1 mg的內(nèi)標(biāo)溶液。

3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取各對(duì)照品一定量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并分別稀釋配成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品系列溶液，見表2?；旌蠈?duì)照品液相色譜圖見圖2。

表2 各對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度 /(μg·mL-1)Tab.2 Concentration of reference substances/(μg·mL-1)

圖2 混合對(duì)照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed reference substances

精密吸取上述對(duì)照品溶液各1 mL，分別置于10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)異補(bǔ)骨脂素溶液(0.1 mg/mL)0.2 mL，加甲醇稀釋至刻度，即得系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行高效液相色譜儀測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL。以對(duì)照品峰面積與異補(bǔ)骨脂素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值 (Ag/As)為縱坐標(biāo) (Y)，相應(yīng)對(duì)照品質(zhì)量濃度 (C，μg/mL)為橫坐標(biāo) (X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相應(yīng)對(duì)照品的回歸方程。結(jié)果見表3。3.4 內(nèi)標(biāo)法校正因子的測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品貯備液1.0、4.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，精密加入異補(bǔ)骨脂素內(nèi)標(biāo)液 (0.1 mg/mL)0.2 mL，加甲醇定容，搖勻，濾過即得。高效液相色譜儀測(cè)定對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算9種對(duì)照品校正因子。結(jié)果見表4。

表3 各對(duì)照品的線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of reference substances

3.5 空白試驗(yàn) 分別將原方中去除川芎、黃芪、防己、青風(fēng)藤藥材，按制劑工藝方法制備分別得到4種陰性制劑。分別取0.1 g陰性制劑，加甲醇25 mL超聲溶解，按定量測(cè)定方法分析，4種陰性樣品色譜在毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿相應(yīng)保留時(shí)間位置無干擾峰。見圖3～6。

表4 各對(duì)照品對(duì)異補(bǔ)骨脂素的相對(duì)校正因子測(cè)定結(jié)果Tab.4 Relative calibration factor test results of different reference substances to isopsoralen

圖3 缺黃芪的陰性制劑色譜圖 (加內(nèi)標(biāo)物)Fig.3 Chromatogram of Qishe Pill sample without Astragali Radix(including internal standard)

圖4 缺川芎的陰性制劑色譜圖 (加內(nèi)標(biāo)物)Fig.4 Chromatogram of Qishe Pill sample without Chuanxiong Rhizome(including internal standard)

圖5 缺防己的陰性制劑色譜圖 (加內(nèi)標(biāo)物)Fig.5 Chromatogram of Qishe Pill sample without Stephaniae tetrandrae Radix(including internal standard)

圖6 缺青風(fēng)藤的陰性制劑色譜圖 (加內(nèi)標(biāo)物)Fig.6 Chromatogram of Qishe Pill sample without Sinomenii Caulis(including internal standard)

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一樣品 (批號(hào)101101)供試液，測(cè)定0、2、4、6、8、10、12、24 h樣品中有效成分，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，供試液中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定，其穩(wěn)定性RSD分別為1.64%、1.31%、1.71%、1.23%、1.86%、1.91%、0.97%、0.90%、1.11%，均小于2%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 精密度試驗(yàn) 同一供試液 (批號(hào)101101)，按照上述方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果供試液中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿的RSD分別為0.63%、0.89%、0.91%、1.06%、0.77%、1.21%、1.43%、0.49%、1.33%，均小于 2%，表明精密度良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批號(hào) (批號(hào)101101)制劑，研缽研碎，精密稱取6份，每份約1.0 g，按3.1項(xiàng)下方法平行操作制備樣品，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿色譜峰面積RSD分別為1.37%、1.11%、0.89%、0.71%、1.41%、1.62%、0.39%、0.97%、0.81%，均小于2%，表明重復(fù)性良好。

3.9 定量限 當(dāng)信噪比為10時(shí)，9種成分進(jìn)樣量見表5。

表5 9種成分定量限Tab.5 Quantitative limits of nine constituents

3.10 回收率試驗(yàn) 同一批號(hào) (批號(hào)101101)制劑，研缽研碎，精密稱取6份，每份約1.0 g，分別加入對(duì)照品溶液適量，按3.1項(xiàng)下方法制備樣品，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果制劑中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、粉防己堿、防己諾林堿、青藤堿的加樣回收率分別為99.69%、98.26%、102.94%、98.64%、97.25%、100.21%、98.53%、99.87%、101.32%。

3.11 樣品測(cè)定 取芪麝丸樣品 (批號(hào)100601、100602、101101)按上述方法測(cè)定，并用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 芪麝丸中9種成分測(cè)定結(jié)果Tab.6 Measurement results of nine constituents in Qishe Pill

4 討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的芪麝丸中的9種成分涉及3類成分，包括黃酮類、萜類及生物堿，其最大吸收波長青藤堿、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素為260 nm，防己諾林堿、粉防己堿、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A為280 nm，其各自的最大吸收雖不同，但均在260～280 nm范圍內(nèi)，經(jīng)全波長掃描并兼顧9種成分最大吸收波長，確定檢測(cè)波長為262 nm，以建立在單波長檢測(cè)器的色譜條件。由于黃芪中黃芪甲苷是紫外末端吸收，最大吸收波長是203 nm左右，干擾較大，常采用ELSD檢測(cè)器測(cè)定，因而本實(shí)驗(yàn)并未考慮采用紫外檢測(cè)器對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行測(cè)定。

4.2 在本制劑色譜圖中出現(xiàn)幾個(gè)峰面積較大的未知物，有待進(jìn)一步確定。

4.3 在固定儀器、固定色譜條件下，要先測(cè)定校正因子，再用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行樣品測(cè)定，并且每次更換色譜條件后，應(yīng)對(duì)校正因子進(jìn)行適時(shí)驗(yàn)證，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

4.4 由于中藥復(fù)方藥味較多，其質(zhì)量控制是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，常采用對(duì)君藥或用藥量較多的藥味的主要成分建立定量測(cè)定方法進(jìn)行質(zhì)量控制，此種傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法較為片面。本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定了芪麝丸中多種成分，且方法穩(wěn)定、精密度高、專屬性好，具有較強(qiáng)實(shí)用性，為其他品種的中成藥質(zhì)量控制方法的建立起到了一定的啟示作用。

致謝:洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品由上海中醫(yī)藥大學(xué)梁爽老師贈(zèng)送。

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