張輝，王樹林，金維忠

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

金黃果，又叫“酸果”，當(dāng)?shù)厝艘卜Q酸梨，是青海省黃南州同仁縣特有的一種水果，似梨，成熟后表皮呈金黃色。受獨特地海拔、氣候、地理、土質(zhì)及溫度等自然因素影響造就了其果味濃郁純正，風(fēng)味獨特，富含果汁，營養(yǎng)豐富，酸甜適口。果酒酒精度低，保留了水果原有的糖類、氨基酸和礦物質(zhì)等，較以糧食為原料的蒸餾酒有較高的營養(yǎng)價值，具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、控制體內(nèi)膽固醇水平、抗衰老等醫(yī)療、保健作用[1-2]。目前酒類消費倡導(dǎo)以低度酒取代高度酒、果酒取代糧食酒。就地取材生產(chǎn)果酒，既可保證水果的新鮮度及釀酒質(zhì)量，又可減少長途運輸所帶來的損失，最終降低生產(chǎn)成本[3-5]。

我國果酒的研究和生產(chǎn)正處于起步階段，技術(shù)水平與發(fā)達(dá)國家成熟的果酒釀造行業(yè)相比還顯得薄弱，存在一些急待解決的問題，如尚未制定科學(xué)統(tǒng)一的行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和完善的管理規(guī)范、缺少專用發(fā)酵菌種、果酒生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)還不成熟、專業(yè)化程度不高等[6]。據(jù)統(tǒng)計，目前我國人均葡萄酒消費不足0.2 L，人均果汁消費量僅為1 L 左右。隨著我國人民生活水平的提高，我國居民對果酒的消費必將逐日增加。本研究旨在利用本地金黃果，結(jié)合國內(nèi)外果酒生產(chǎn)的技術(shù)，通過對工藝參數(shù)的優(yōu)化，篩選金黃果果汁酒精發(fā)酵工藝，為生產(chǎn)具有高原特色發(fā)酵型果酒做初步的理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

1.1.1 材料

金黃果：購于青海省黃南州。葡萄酒酵母（Danster FERMENT AG Alpenstrass 12 ch 6304 ZUG Switzerland subsidiary of lallemand Inc product of Denmark）：由清華博眾生物有限公司提供。

1.1.2 試劑

瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑廠；0.1 mol/L 亞硫酸鈉溶液：天津市耀華化工廠；飽和碳酸鈣溶液：中國泗聯(lián)化工廠；1 mol/L 檸檬酸溶液：萊陽化工實驗廠。

1.1.3 儀器和設(shè)備

超低溫?fù)u床HWY2ll2 型：上海智城分析儀器制造有限公司；HWS150 型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；ES315 型自動殺菌鍋：日本TOMY 公司；HS600D 型超聲波清洗機(jī)：寧波市北侖樺升超聲波機(jī)械廠；氣相色譜儀：日本島津GC-17A；電子天平JA2003：上海精科天平。

1.2 測定指標(biāo)

1.2.1 殘?zhí)橇?/p>

接種酵母后第6 天開始到第18 天，每天測定發(fā)酵瓶中發(fā)酵醪的含糖量。并以糖轉(zhuǎn)化的速度作為發(fā)酵速度。

1.2.2 色澤，口味

發(fā)酵完成后，通過觀察，品嘗進(jìn)行感官評定及分析。按照表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)的要求，從色澤、口味兩個個方面進(jìn)行感官評定，對得分進(jìn)行加權(quán)平均。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory quality standard

1.3 試驗研究

1.3.1 金黃果表皮酵母的培養(yǎng)和篩選

1.3.1.1 培養(yǎng)基的制備（沙氏培養(yǎng)基）

培養(yǎng)基A：葡萄糖1%，蛋白胨1%，瓊脂2.2%，氯化鈉0.5%，pH 5.0～6.0，在115 ℃下高壓滅菌30 min。

培養(yǎng)基B：葡萄糖4%，蛋白胨1%，瓊脂2%，pH 5.0～6.0，115 ℃下高壓滅菌30 min。

1.3.1.2 金黃果酵母選育

平板培養(yǎng)：無菌條件下，用鑷子取少量金黃果表皮涂抹在沙氏培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在28 ℃～30 ℃，保持一定的濕度。

平板分離：對培養(yǎng)出來的菌落進(jìn)行鏡檢，挑選酵母菌菌落，在沙氏培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，在同樣的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直到平板上長出單菌落為止，勾取該菌落的三分之一進(jìn)行鏡檢，挑選出純的菌落。

試管斜面培養(yǎng)：勾取純菌落的三分之一接種到斜面上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)出來的酵母即為純種的酵母菌。

試管果汁培養(yǎng)：從斜面上勾取一定量的酵母接種到裝有純果汁的試管中，在接種過程當(dāng)中，對勾取的酵母要在試管壁上用接種環(huán)進(jìn)行碾磨破碎，酵母培養(yǎng)過程中，每隔兩個小時振搖試管一次，以便酵母的快速繁殖，培養(yǎng)時間一般為24 h～36 h，培養(yǎng)好的酵母可直接加入到發(fā)酵瓶中進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 正交試驗篩選金黃果酵母的最佳發(fā)酵工藝

發(fā)酵溫度，發(fā)酵液pH，金黃果酵母接種量為試驗因素，設(shè)計L9（34）正交試驗篩選金黃果酵母發(fā)酵金黃果果汁的最佳工藝條件。試驗因素水平見表2。

表2 金黃果酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗因素水平Table 2 Factors and level of orthogonal tests on golden yellow fruit yeast best fermentation process screening

1.3.3 正交試驗篩選葡萄酒酵母的最佳發(fā)酵工藝

以發(fā)酵溫度，發(fā)酵液pH，葡萄酒酵母接種量為試驗因素，采用L9（34）正交試驗篩選葡萄酒酵母發(fā)酵金黃果果汁的最佳的工藝條件，試驗因素水平見表3。

表3 葡萄酒酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗因素水平表Table 3 Factors and level of orthogonal tests on grape wine yeast best fermentation process screening

1.3.4 SO2（以亞硫酸鈉計）添加量對金黃果酒精發(fā)酵效率的影響試驗

在正交試驗篩選的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)基礎(chǔ)上，設(shè)計單因素試驗，探討SO2添加量對金黃果酵母和葡萄酒酵母酒精發(fā)酵速度的影響。SO2（以亞硫酸鈉計）添加量為60、80、100、120 mg/L。

1.3.5 金黃果果酒酒生產(chǎn)工藝

2 結(jié)果與討論

2.1 金黃果酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗

金黃果酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗結(jié)果，見表4。

表4 金黃果酵母最佳的發(fā)酵工藝篩選的正交試驗結(jié)果Table 4 Result of orthogonal test on golden yellow fruit yeast best fermentation process screening

比較表4 中的極差R 值可知，發(fā)酵溫度對金黃果果汁酒精發(fā)酵速度的影響是最大的，其次為發(fā)酵液pH，金黃果酵母接種量對發(fā)酵速度的影響是最小的，最佳的發(fā)酵條件為A3B2C1即發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵液pH 為3.5，金黃果酵母接種量為3%。

正交試驗方差分析結(jié)果見表5。由表5 可知，因素A 即發(fā)酵溫度對金黃果果汁酒精發(fā)酵速度的影響明顯（P＜0.05），發(fā)酵液pH（P＞0.05）和金黃果酵母接種量對發(fā)酵速度影響不明顯（P＞0.05），發(fā)酵溫度為主要因素，發(fā)酵液pH 和金黃果酵母接種量為次要因素。

2.2 葡萄酒酵母最佳發(fā)酵工藝篩選正交試驗

葡萄酒酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗結(jié)果見表6。

表5 金黃果酵母最佳的發(fā)酵工藝篩選的正交試驗方差分析表Table 5 The variance analysis and orthogonal test of golden yellow fruit yeast best fermentation process screening

表6 葡萄酒酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗結(jié)果表Table 6 Result of orthogonal tests on grape wine yeast best fermentation process screening

比較表6 中的極差R 值可知，發(fā)酵液pH 對金黃果果汁酒精發(fā)酵效果的影響是最大的，其次為發(fā)酵溫度，葡萄酒酵母對發(fā)酵的接種量影響是最小的，最佳的發(fā)酵條件為A2B2C3即發(fā)酵溫度為20 ℃，發(fā)酵液pH為3.5，金黃果酵母接種量為9%。

葡萄酒酵母最佳發(fā)酵工藝篩選的正交試驗方差分析結(jié)果，見表7。

表7 金黃果酵母最佳的發(fā)酵工藝篩選的正交試驗方差分析結(jié)果表Table 7 The variance analysis and orthogonal test of golden yellow fruit yeast best fermentation process screening

由表7 可知，因素B 即發(fā)酵液pH 對金黃果果汁酒精發(fā)酵的影響差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度（P＞0.05）和金黃果酵母接種量（P＞0.05），差異不顯著，發(fā)酵液pH 為主要因素，發(fā)酵溫度和葡萄酒酵母接種量為次要因素。

雖然隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵速度增加，但果酒釀造大多需要在較低的發(fā)酵溫度（25 ℃以下），以保證產(chǎn)品風(fēng)味[7]。本試驗充分考慮發(fā)酵速度和產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)系，發(fā)酵溫度的最高水平為25 ℃。

在金黃果果酒的釀造中，酵母菌菌種的性能不僅影響發(fā)酵速度，同時也影響到果酒的品質(zhì)[8]。本試驗結(jié)果表明，接種金黃果酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵開始階段，果汁總糖含量下降很慢即發(fā)酵速率很慢；而接種葡萄酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵時，發(fā)酵速率很快。發(fā)酵過程中金黃果酵母的發(fā)酵速度相對較慢，所需發(fā)酵時間較長，而葡萄酒酵母的發(fā)酵速率較快，完成發(fā)酵所需的時間相對較短。其原因是金黃果酵母的發(fā)酵能力很弱，而葡萄酒酵母的發(fā)酵能力很強(qiáng)，在很短的時間里就能繁殖到一定程度，并進(jìn)行酒精發(fā)酵。

2.3 SO2 添加量對金黃果果汁酒精發(fā)酵效率的影響

2.3.1 SO2添加量對金黃果酵母金黃果果汁發(fā)酵效率的影響

SO2添加量對金黃果酵母發(fā)酵效率的影響試驗結(jié)果，見表8 和圖1。

表8 SO2（以亞硫酸鈉計）添加量對金黃果酵母發(fā)酵效率的影響Table 8 Effcet of SO2（counts the recruitment by sodium sulfite）on the golden yellow fruit yeast fermentation

圖1 二氧化硫添加量對金黃果酵母發(fā)酵效率的影響Fig.1 Effcet of SO2(counts the recruitment by sodium sulfite)on the golden yellow fruit yeast fermentation

由表8、圖1 可見，金黃果酵母的發(fā)酵速度隨著SO2添加量的增加，發(fā)酵速度降低。當(dāng)SO2的量超過80 mg/L 時，酒精發(fā)酵明顯受阻，發(fā)酵速度降低，特別是在酒精發(fā)酵的開始階段。綜合考慮抑菌效果及發(fā)酵速度，確定SO2添加量為80 mg/L。

2.3.2 SO2添加量對葡萄酒酵母金黃果果汁酒精發(fā)酵效率的影響

SO2添加量對葡萄酒酵母發(fā)酵效率的影響試驗結(jié)果，見表9 和圖2。

表9 SO2（以亞硫酸鈉計）添加量對葡萄酒酵母發(fā)酵效率的影響Table 9 Effect of SO2（counts the recruitment by sodium sulfite）on the grape wine yeast fermentation

圖2 二氧化硫添加量對葡萄酒酵母發(fā)酵效率的影響Fig.2 Effect of SO2(counts the recruitment by sodium sulfite)on the grape wine yeast fermentation

由表9、圖2 可知，葡萄酒酵母的發(fā)酵速度隨著SO2添加量的增加，發(fā)酵速度降低。當(dāng)SO2的量超過100 mg/L 時，酒精發(fā)酵明顯受阻，發(fā)酵速度降低，特別是酒精發(fā)酵的開始階段。綜合考慮抑菌效果及發(fā)酵速度，確定SO2添加量為100 mg/L。

二氧化硫（SO2）在果酒生產(chǎn)中的作用為殺菌、澄清、抗氧化、增酸、改善口味等，由于釀酒酵母對其具有較強(qiáng)的耐受能力，所以通常在果酒起始發(fā)酵前，添加一定量的SO2，以抑制不良微生物的生長、繁殖與代謝，起到選擇性殺菌的作用，促進(jìn)發(fā)酵的順利進(jìn)行[9-11]，酵母在耐受SO2的量的范圍內(nèi)，隨著SO2添加量的增加，酒精發(fā)酵的速率會變慢，但酒精發(fā)酵結(jié)果相近即殘?zhí)橇肯嘟?。因此在酒精發(fā)酵過程中，適量添加SO2可以使酒精發(fā)酵開始階段的速率變慢，使得酒精發(fā)酵的整體速率變的較為緩慢。

3 結(jié)論

在金黃果果汁酒精發(fā)酵過程中，葡萄酒酵母對發(fā)酵的接種量影響是最小的，最佳的發(fā)酵條件為A2B2C3即發(fā)酵溫度為20 ℃，發(fā)酵液pH 為3.5，金黃果酵母接種量為9%。影響金黃果酵母發(fā)酵的主要因素是發(fā)酵溫度，發(fā)酵液pH 和金黃果酵母接種量的影響程度相對較弱。影響葡萄酒酵母發(fā)酵的主要因素是發(fā)酵液pH，發(fā)酵溫度和葡萄酒酵母接種量的影響相對較弱。金黃果酵母適宜的SO2添加量為80 mg/L，葡萄酒酵母適宜的SO2添加量為100 mg/L。

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