劉培，張霞，曲鵬，吳冬雪，趙良娟，張海英，高旗利，張宏偉，鄭文杰

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

本研究共采用來自10 個(gè)不同國家樣品中分離出來的阪崎腸桿菌菌株34 株，利用Riboprinter 系統(tǒng)對這34 株阪崎腸桿菌進(jìn)行基因鑒定，應(yīng)用BioNumerics 軟件對不同來源地菌株的基因分型結(jié)果進(jìn)行對比研究，做出阪崎腸桿菌同一地域和不同地域菌株的親緣圖譜。對不同地域的阪崎腸桿菌的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

34 株試驗(yàn)菌株（見表1）；改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（mLST-Vm）；阪崎腸桿菌檢測顯色培養(yǎng)基；營養(yǎng)肉湯；營養(yǎng)瓊脂；VITEK GNI 檢測試劑；Riboprinter 試劑盒。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Riboprinter 系統(tǒng)：美國杜邦公司；VITEK32 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)：法國生物梅里埃；BioNumerics 數(shù)據(jù)庫軟件5.0：APPLIED MATHS 公司；常規(guī)培養(yǎng)法必備的儀器設(shè)備和器具。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.3 方法

1.3.1 目標(biāo)菌生化鑒定

根據(jù)GB/T 4789.40-2008《阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》對試驗(yàn)用34 株目標(biāo)菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基上挑取藍(lán)綠色菌落，接種營養(yǎng)瓊脂，挑取營養(yǎng)瓊脂上的菌落進(jìn)行生化鑒定。生化鑒定選用VITEK32 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。生化鑒定結(jié)果為試驗(yàn)用34 株目標(biāo)菌全部為阪崎腸桿菌。

1.3.2 目標(biāo)菌16SrDNA 序列分析

根據(jù)《GB/T 4789.40-2008 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》對試驗(yàn)用34 株目標(biāo)菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基上挑取藍(lán)綠色菌落，接種營養(yǎng)瓊脂，挑取營養(yǎng)瓊脂上的菌落進(jìn)行基因鑒定。利用Riboprinter 系統(tǒng)對上述目標(biāo)菌進(jìn)行16SrDNA 序列分析。

加熱元件通常為鉬帶或鉬絲，鉬帶雖然使用壽命長，可靠性高，但制造成本高。綜合考慮，鉬板加熱電阻爐采用鉬絲作為加熱元件[5]。

1.3.3 應(yīng)用BioNumerics 軟件對目標(biāo)菌進(jìn)行基因分析

將Riboprinter 系統(tǒng)分析得到的34 株目標(biāo)菌的rRNA 基因指紋圖，與Riboprinter 數(shù)據(jù)庫比較進(jìn)行基因分型；創(chuàng)建RiboPrinterR模式，從而產(chǎn)生每個(gè)樣品的基因指紋圖譜。將這34 株菌的基因指紋圖譜輸入BioNumerics 軟件，運(yùn)用BioNumerics 數(shù)據(jù)庫軟件建立相應(yīng)的核糖體指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行指紋圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲和大洋洲

分別以澳大利亞和新西蘭代表澳洲和大洋洲。

圖1 為6 株來源為澳大利亞的阪崎腸桿菌菌株的親緣關(guān)系圖譜比較。

這6 株菌的基因指紋圖譜的相似性很高，其中編號為19-1、19-4、12-3、5-4 的這4 株菌的基因指紋圖的相似性在90%以上，可以被認(rèn)為這4 株菌為相似的基因型。另2 株編號為19-6 和12-2 的菌株與這4 株的相似性也在83%以上。

圖2 為8 株來源為新西蘭的阪崎腸桿菌菌株的親緣關(guān)系圖譜比較。

圖2 中編號為5-1、5-3、5-7 的3 株菌的基因指紋圖相似性在90%以上，認(rèn)為基因型相似。編號為12-5 和19-3 的菌株與上述3 株菌的基因指紋圖相似性為75%以上。而編號為12-6 的菌株與其他菌株的相似性不到40%，被認(rèn)為親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不屬于同一種。

圖3 為來源澳大利亞和新西蘭的菌株的親緣關(guān)系圖譜比較。

這14 株阪崎腸桿菌中的12 株的基因指紋圖譜相似性在75%以上。只有編號為7-8 和12-6 的2 株菌與其他12 株菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 美洲

美洲分為北美洲和南美洲來進(jìn)行分析。北美洲的代表國家為美國，南美洲選擇烏拉圭和阿根廷做為代表。

圖4 為5 株來源美國的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。圖中顯示這5 株來自美國的阪崎腸桿菌菌株的親緣關(guān)系都在78%以下，親緣較遠(yuǎn)。

圖5 為5 株來源南美洲的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。其中編號為6-1、6-2、5-6 和5-8 的菌株來源烏拉圭，編號為7-7 的菌株來源阿根廷。圖中顯示來源烏拉圭的4 株菌的基因指紋圖相似性在90%以上，具有相似的基因型。而與阿根廷的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似性為65%以下。

圖6 為10 株來源美洲的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。

來源于美國的編號為5-5 和12-4 的菌株與來源于烏拉圭的菌株親緣關(guān)系較近，在80%以上，其他菌株的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。

2.3 歐洲

圖7 為8 株來自歐洲的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。

其中來源荷蘭的編號為12-1、19-5 和來源奧地利的編號為19-7、12-8 的4 株菌基因指紋圖相似性在85%以上，具有相似的基因型。同樣來源荷蘭的12-1 和7-3 為同一樣品荷蘭金裝幼兒成長奶粉中提取的阪崎腸桿菌，由于生化反應(yīng)不同，因此保存為兩個(gè)菌株。圖7 的結(jié)果表明這2 株菌的基因指紋圖相似性不到40%。

2.4 中國

來源于中國的2 株阪崎腸桿菌為市售奶粉中分離得到。圖8 為這2 株菌的基因指紋圖譜比較。

從圖8 中可以看出這2 株菌的基因指紋圖相似性在50%左右，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 不同地域

將全部34 株阪崎腸桿菌進(jìn)行基因指紋圖的對比，結(jié)果見圖9。

圖9 中有2 組菌株的基因指紋圖相似性在80%以上。第一組菌株的編號為12-5、19-6、12-1、19-8、12-8、12-2、19-5、19-7。分別來自新西蘭、澳大利亞、荷蘭、美國和奧地利。第二組菌株的編號為5-1、5-2、5-4、6-1、6-2、5-3、5-5、5-6、5-7、5-8、19-1、19-4、12-3。分別來自新西蘭、荷蘭、澳大利亞、烏拉圭和美國。其中第二組中編號為5-1、5-2、5-4、6-1、6-2 的菌株的基因指紋圖相似性達(dá)到98%以上。

3 結(jié)論

通過對不同地域阪崎腸桿菌進(jìn)行基因指紋圖譜的分析，可以看出來源于澳大利亞的阪崎腸桿菌的基因指紋圖譜相似性很高，基本都在90%以上，是基因型相似的阪崎腸桿菌菌株。來源于新西蘭的阪崎腸桿菌相似性基本在75%以上，親緣關(guān)系也比較接近。由于澳大利亞和新西蘭距離較近，都在南半球，因此將來源于澳大利亞和新西蘭的菌株的基因指紋圖做了分析，分析發(fā)現(xiàn)85%以上的菌株的指紋圖譜相似性在75%以上。通過對來源于美國的阪崎腸桿菌基因指紋圖的分析顯示來源美國的菌株親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。而來源于烏拉圭的菌株基因指紋圖的相似性全部都在90%以上，屬于基因型相似的菌株。從來自歐洲的菌株基因指紋圖的分析我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)值得注意的結(jié)果就是同為來源于荷蘭的一份樣品中提取的阪崎腸桿菌菌株，由于生化反應(yīng)不同，其基因指紋圖的相似性很低，親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，可以認(rèn)為是克羅諾桿菌屬的兩個(gè)不同種菌株。可以看出生化型的不同對菌株基因型的影響很大。而中國市售奶粉由于來源不明，因此親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而對不同來源地的阪崎腸桿菌菌株的分析表面來自不同國家和不同大洲的菌株也可能為同一來源的菌株。

通過對上述結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)來源澳大利亞和來源烏拉圭的菌株各自之間的親緣關(guān)系很近，基本屬于相似或相同的基因型。而來源其他國家的菌株之間的親緣關(guān)系沒有什么規(guī)律可循，尤其值得注意的是同一樣品中分離出得到兩個(gè)種的阪崎腸桿菌菌株。而來自不同國家和不同大洲的菌株也可能為同一來源的菌株。

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