張曉云，謝玲燕，季明敏，米蘭，董英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

芡實(shí)（又名雞頭米）是一種睡蓮科水生草本植物，廣泛分布于我國南方各地的湖泊、池塘、灘地、水溝中。其味味甘澀性平，是國家衛(wèi)生部公布的首批“藥食兼用”材料之一。芡實(shí)種仁中含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物等基本營養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)的含量與黃花菜、銀耳、木耳等相當(dāng)[1]，且氨基酸的種類齊全，配比合理，具有較高的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值[2]。但到目前為止，對(duì)芡實(shí)蛋白的提取分離卻很少研究報(bào)道。本文通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)芡實(shí)蛋白提取條件進(jìn)行了優(yōu)化?？紤]到芡實(shí)壁厚、質(zhì)地較硬，傳統(tǒng)方法提取蛋白質(zhì)難以充分?jǐn)U散出來、提取率低；而采用超聲提取技術(shù)具有簡便快速、高效節(jié)能、重復(fù)性好、不影響提取物的活性等優(yōu)點(diǎn)[3]。因此在正交試驗(yàn)優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)超聲波輔助提取芡實(shí)蛋白質(zhì)的工藝進(jìn)行研究，確定了最佳輔助提取工藝參數(shù)，為芡實(shí)深加工和綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

干芡實(shí)：購自蘇州，超微粉碎機(jī)粉碎后過120 目篩，烘干備用。

1.2 主要試劑

NaOH（AR）、磷酸（AR 85%）、無水乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250 等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。牛血清白蛋白購自生工生物工程（上海）有限公司。

考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：將結(jié)晶牛血清白蛋白用0.15 mol/LNaCl 配制成100 μg/mL 蛋白溶液。

1.3 儀器與設(shè)備

WK-1000A 高速藥物粉碎儀：青州市精誠機(jī)械有限公司；PHS-3BW 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；SHZ-10 組合式水浴恒溫?fù)u床：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-1601 微量紫外分光光度計(jì)：日本島津；GA99-ⅡD 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：無錫市上佳生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 芡實(shí)蛋白的提取

稱取1.0g 芡實(shí)粉，加入一定體積去離子水，40 ℃振搖浸提12 h 后，以1 mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH，在一定條件下置于水浴搖床上振蕩提取。提取結(jié)束后，10 000 r/min離心20 min，收集上清液、定容。

1.4.2 芡實(shí)蛋白含量的測定

取定容后的提取液，考馬斯亮藍(lán)法（Bradford 法）測定蛋白濃度[4]。根據(jù)濃度計(jì)算1.0 g 芡實(shí)粉所提取的總蛋白的量，以1.0 g 芡實(shí)粉所得到的總蛋白量為指標(biāo)評(píng)價(jià)提取效果。

1.4.3 芡實(shí)蛋白提取條件的選擇

在其它條件相同條件下，分別研究不同pH、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間等單因素對(duì)芡實(shí)蛋白提取的影響。

1.4.4 芡實(shí)蛋白提取條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對(duì)芡實(shí)蛋白提取條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1.4.5 超聲輔助提取蛋白工藝

稱取1.0 g 芡實(shí)粉，按照1 ∶25（g/mL）的料液比，調(diào)節(jié)pH 為11 或14，在設(shè)定條件下提取。提取結(jié)束后，使用φ10 變幅桿，在一定條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，提取時(shí)以冰浴降溫。然后4 ℃10 000 r/min 離心20 min。離心結(jié)束后，收集上清液，定容待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 芡實(shí)蛋白提取條件的選擇

2.1.1 pH 對(duì)芡實(shí)蛋白提取的影響

按照芡實(shí)粉和去離子水為1：10（g/mL），進(jìn)行浸提。然后分別調(diào)節(jié)pH 為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，在40 ℃條件下進(jìn)行提取，考察pH 對(duì)芡實(shí)蛋白提取效果的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 pH 對(duì)芡實(shí)蛋白提取量的影響Fig.1 Effects of pH values on extraction of protein

由圖1 可以看出，芡實(shí)蛋白在pH 低于10 時(shí)，總提取量均很低，而且pH 改變對(duì)提取效果基本沒有影響。pH 高于10 時(shí)，蛋白提取量隨著pH 升高呈升高的趨勢。pH 超過11，升高趨勢減緩。從pH 13 升至pH14，蛋白提取量升高非常顯著。這是因?yàn)槿芤簆H 的變化，一方面可促進(jìn)顆粒胞膜的破裂和溶解，增加蛋白質(zhì)從顆粒中的溶出；另一方面可以改變蛋白質(zhì)的帶電狀況，直接影響到蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和水之間的相互作用，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶出率的變化[5]。但是蛋白質(zhì)經(jīng)強(qiáng)堿性作用后會(huì)導(dǎo)致粘度增加，擴(kuò)散系數(shù)降低，而且容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)營養(yǎng)性質(zhì)的破壞甚至產(chǎn)生毒性[6-7]。綜合考慮，在pH 為11 時(shí)提取芡實(shí)蛋白較為合適，因此在以下實(shí)驗(yàn)中選用pH11 時(shí)優(yōu)化其它提取條件。

2.1.2 料液比對(duì)芡實(shí)蛋白提取的影響

在pH11、40 ℃條件下提取，按照芡實(shí)粉和去離子水之比（g/mL）分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 進(jìn)行浸提，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)芡實(shí)蛋白提取量的影響Fig.2 Efect of solid/liquid ratios on extraction of protein

由圖2 可見，隨著料液比的增加，蛋白總提取量逐漸增大，可能是料液比的增大有利于蛋白質(zhì)在料液中的溶出。當(dāng)料液比超過1 ∶25（g/mL）時(shí)，蛋白提取總量不再增加。

2.1.3 溫度對(duì)蛋白提取的影響

按照芡實(shí)粉和去離子水為1 ∶10（g/mL）進(jìn)行浸提，調(diào)節(jié)pH 11 后分別在30、40、50、60 ℃條件下提取芡實(shí)蛋白，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)芡實(shí)蛋白提取量的影響Fig.3 Effects of temperature on extraction of protein

由圖3 可以看出，在pH11 時(shí)，提取溫度從40 ℃升高到50 ℃，蛋白提取量迅速增加，50 ℃達(dá)到最大值。這是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的溶解度增大，提取率增加。溫度升高到60 ℃時(shí)，蛋白提取總量略有降低?？赡苁菧囟冗^高引起部分蛋白質(zhì)變性，影響了蛋白質(zhì)的溶解性，從而使提取率下降，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)營養(yǎng)性質(zhì)的破壞[7]。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取的影響

按照芡實(shí)粉和去離子水為1 ∶10（g/mL）進(jìn)行浸提。調(diào)節(jié)pH11 后再分別在40℃條件下提取1、2、4、8、12 h，結(jié)果見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)芡實(shí)蛋白提取量的影響Fig.4 Effect of extracting times on extraction of protein

由圖4 可以看出，蛋白提取總量隨著提取時(shí)間的增加而增加，在4 h 時(shí)達(dá)最高。之后隨著提取時(shí)間的增加提取總量開始下降，這可能是由于提取時(shí)間太長，在提取條件下蛋白開始被降解，同時(shí)因?yàn)楦邷?、?qiáng)堿作用后的蛋白質(zhì)，其氫鍵被打斷、空間結(jié)構(gòu)被破壞、較多的疏水基團(tuán)暴露至表面，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性改變，最終提取總量降低。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化谷蛋白提取條件

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，在pH 11 條件下，通過正交試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間、料液比、溫度等影響因素進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)L9（34）的方案和結(jié)果如表1和表2。

表1 試驗(yàn)因素和水平表Table 1 The factors and levels of otthogonal test

由表2 試驗(yàn)結(jié)果和方差分析可以看出，溫度對(duì)芡實(shí)蛋白提取影響最大，其實(shí)是時(shí)間和料液比。各因素影響大小排序?yàn)椋簻囟龋緯r(shí)間＞料液比。根據(jù)各因素水平的平均值可以得出的最佳提取條件為A1B2C3。將得到的優(yōu)選條件與正交試驗(yàn)中提取量最高的條件A2B2C3同時(shí)再做重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果A1B2C3條件下的提取量為3 100 μg，而A2B2C3條件下的提取量為3 262 μg。經(jīng)綜合考慮確定芡實(shí)蛋白的最佳提取條件為：芡實(shí)按照1 ∶25（g/mL）的料液比浸提后，在pH 11 條件下，50°C提取2 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.3 超聲波輔助提取芡實(shí)蛋白

2.3.1 超聲功率對(duì)蛋白提取的影響

在正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳條件下提取芡實(shí)蛋白，提取結(jié)束后設(shè)定超聲條件為工作時(shí)間2 s，間歇時(shí)間4 s，工作總時(shí)間3 min，分別設(shè)定超聲功率為200、400、600、800 W 進(jìn)行超聲輔助提取，以考察不同超聲功率對(duì)蛋白提取效果的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 超聲功率對(duì)芡實(shí)蛋白提取量的影響Fig.5 Effect of Ultrasonic power on extraction of protein

由圖5 可見，隨著功率的增加，蛋白提取量略有增加，這是由于超聲功率增大，空化效應(yīng)更加劇烈，超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的溶出速率增加，同時(shí)超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)也會(huì)促進(jìn)溶劑向芡實(shí)顆粒表面擴(kuò)散，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出?？紤]到功率太大的經(jīng)濟(jì)成本增加，因此以800 W 作為超聲波輔助提取的設(shè)定功率值。

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取的影響

設(shè)定超聲功率為800 W，工作時(shí)間為2 s，間歇時(shí)間4 s，工作總時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、25 min 進(jìn)行超聲輔助提取，考察不同超聲時(shí)間對(duì)蛋白提取效果的影響。結(jié)果如圖6。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)芡實(shí)蛋白提取量的影響Fig.6 Effect of Ultrasonic time on extraction of protein

由圖6 可見，隨著超聲提取時(shí)間的延長，超聲波對(duì)原料作用也越充分，蛋白提取量增加。當(dāng)超聲時(shí)間為20 min 時(shí)，提取量達(dá)峰值，之后開始下降，可能是因?yàn)槌曁幚頃r(shí)間的過長導(dǎo)致蛋白與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[8]以及蛋白發(fā)生變性，因而水溶性變差的結(jié)果。

3 結(jié)論

1）在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)得到芡實(shí)蛋白的最佳提取條件為：芡實(shí)按照1 ∶25（g/mL）的料液比浸提后，在pH 11 下，50°C 提取2 h。

2）與單一采取堿提法相比，超聲波輔提法不僅可省掉芡實(shí)的浸提前處理過程，而且在優(yōu)化的最佳條件下提取芡實(shí)蛋白后，再用超聲波進(jìn)行輔助提?。ㄔO(shè)定超聲功率800 W，工作時(shí)間2 s，間歇時(shí)間4 s，超聲提取20 min），蛋白提取量達(dá)8 435 μg，是未超聲時(shí)提取量的2.5 倍多。

[1] 夏紅,曹衛(wèi)華.芡實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值及保鮮加工[J]. 食品工業(yè),2004(10):27-28

[2] 張名位,池建偉,孫玲,等.潮州芡實(shí)的營養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),1999(2):27-29

[3] 鄔方寧.超聲提取技術(shù)在現(xiàn)代中藥中的應(yīng)用[J].中草藥,2007,38(2):315-316

[4] 王文平,郭祀遠(yuǎn),李琳,等.考馬斯亮藍(lán)法測定野木瓜多糖中蛋白質(zhì)的含量[J].食品研究與開發(fā),2008(1):115-117

[5] 張濤.鷹嘴豆分離蛋白的制備及其功能性質(zhì)研究[D].無錫:江南大學(xué),2005:25

[6] Woodard J C,Alvarez M R.Renal lesions in rats fed diets containing α-protein[J].Archives of pathology,1967,84:153-162

[7] Ana Cristina Lopes Barbosa,Franco M Lajolo,MariaInes Genovese.Influence of temperature,pH and ionic strength on the production of isoflavone rich soy protein isolates[J].Food chemistry,2006,98:757-766

[8] 王艷萍,李雙喜,程巧玲.超聲提取蠶豆蛋白的研究[J].食品研究與開發(fā),2008,295):70-72