張晴晴，侯惠靜，劉愛(ài)國(guó)，張佳慧，帖航，吳子健

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Ovotransferrin，OVT）又稱(chēng)副卵白蛋白或卵伴白蛋白，是禽蛋清中一種含686 個(gè)氨基酸殘基的單肽鏈糖蛋白，其約占雞蛋蛋清蛋白總量的12%。該蛋白分子質(zhì)量為78 ku～80 ku，pI 為6.0，天然狀態(tài)下，其分子中所含的半胱氨酸殘基均參與形成穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的二硫鍵，總共有15 個(gè)二硫橋鍵[1]?？山Y(jié)合鐵、銅、鋅等金屬離子，具抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒活性以及提高免疫力等生理功能。在制藥工業(yè)和食品工業(yè)極具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前國(guó)內(nèi)外用于提取制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白方法有鹽沉淀法、膜分離技術(shù)法、陰陽(yáng)離子樹(shù)脂交換法以及乙醇析出法，但提取蛋白的純度較低；也有固定化金屬螯合親和色譜法產(chǎn)量雖有所提高，但過(guò)程較為復(fù)雜，且產(chǎn)量也較低。本文主要研究醇析法結(jié)合弱酸性陽(yáng)離子交換法提取分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的工藝條件，目的在于既提高卵轉(zhuǎn)鐵蛋白制備的產(chǎn)量，又有效提高產(chǎn)品的純度。

1 材料與方法

1.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白制備工藝路線

原蛋清→蛋清預(yù)處理→兩步醇析→兩步弱酸性陽(yáng)離子層析→透析除鹽→冷凍干燥→產(chǎn)品

1.2 材料及儀器

新鮮雞蛋：超市購(gòu)買(mǎi)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；3-18K 低溫高速離心機(jī)：德國(guó)Sigma 公司；FDU-810 型EYELA 冷凍干燥機(jī)：日本東京理化公司；JY-SCZ2+型電泳槽、JY600 型電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；WFZ800-D3B 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；AUW120D 電子天平：SHIMADZU 公司；Bio-rad 凝膠電泳成像儀：bio-rad laboratories-Segrate Milan ltaly。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定[2]

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定所提取樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 電泳[3]

SDS-PAGE 電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品條件：12%的分離膠和5 %的濃縮膠，上樣量10 μL，蛋白質(zhì)濃度為1 mg/mL，200 V 恒壓電泳1 h。

1.3.3 蛋清的預(yù)處理[4-5]

蛋清預(yù)處理參照2001年Thomas Croguennec 等和2005年C Guérin-Dubiard 等的方法并稍加改進(jìn)。取新鮮雞蛋，手工分離得到蛋清，加入3 倍去離子水混勻稀釋?zhuān)? 層紗布過(guò)濾除去不溶性物，濾液用1 mol/L HCl調(diào)pH 至6.0，4 ℃下攪拌過(guò)夜，之后置于4 ℃下3 000×g離心5 min。離心后，上清液即為“無(wú)黏蛋白”蛋清（“mucin-free”EW）。

1.3.4 乙醇析出法提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品[6]

將經(jīng)1.3.3 法預(yù)處理后的蛋清的pH 調(diào)節(jié)至pH9.0，按照2008年K.Y.Ko 等的方法，采用乙醇析出法提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品，方法簡(jiǎn)要如下：將經(jīng)1.3.3 法預(yù)處理好的蛋清溶液pH 調(diào)節(jié)至9.0，加入NaHCO3、NaCl 和FeCl3至終濃度分別為50 mmol/L、150 mmol/L和20 mmol/L，攪拌30 min 并加入乙醇至終濃度為43%（體積分?jǐn)?shù)）后離心（4 ℃，3 220 g，20 min）取上清再滴加乙醇至終濃度為59 %，室溫下攪拌30 min 后離心（4 ℃，3 220 g，20 min）取沉淀復(fù)溶于檸檬酸鹽緩沖液（50 mmol/L）中并調(diào)節(jié)pH 至4.7，再加入已處理的pH 為4.7 的陽(yáng)離子樹(shù)脂并室溫下攪拌3 h，過(guò)濾出去樹(shù)脂，濾液凍干得OVT 粗品。

1.3.5 兩步弱酸性陽(yáng)離子交換層析法進(jìn)一步純化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白[7]

參照2005年C Guérin-Dubiard 等的方法進(jìn)行離子交換層析，略有改進(jìn)，具體如下：經(jīng)1.3.4 法提取的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品用磷酸緩沖液（pH8.0、20 mmol/L）溶解，至終濃度50 mg/mL，并用NaOH（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)pH 至8.0，蛋白溶液經(jīng)低溫離心（4 ℃、6 000 g、30 min）得到蛋白濾液再經(jīng)兩步離子交換層析：第一步為pH8.0 弱酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂去除堿性蛋白（緩沖液為：pH8.0 20 mmol/L 磷酸緩沖液；洗脫液為：0.5 mol/L NaClpH8.0 20 mmol/L 磷酸緩沖液；流速為20 mL/min；柱子25 cm×3 cm）收集峰1 組分；第二步為pH5.2 弱酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品（緩沖液為：pH5.2 10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液；洗脫液為：0.5 mol/L NaCl-pH5.2 10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液；流速為20 mL/min；柱子25 cm×3 cm），收集峰2 組分含有卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，再經(jīng)透析除鹽（4 ℃，24 h）就會(huì)得到高純度的產(chǎn)品，最后進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇析出法提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品的結(jié)果

堿性條件下（pH=9.0）并有伴陰離子（HCO3-）的存在下，OVT 可通過(guò)HCO3-與Fe3+形成三元復(fù)合體，即Fe3+2-HCO3-OVT 復(fù)合物，呈橙紅色。OVT 蛋白分子中的N-端瓣和C-端瓣各含有一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)[8]，其中N-端瓣中的4 個(gè)氨基酸殘基（即Asp60、Tyr191、Tyr92和His250）與來(lái)自伴陰離子的HCO3-共擁有6 個(gè)可與Fe3+結(jié)合的配位鍵，同樣C-端瓣的Asp395、Tyr524、Tyr431 和His592 也與來(lái)自一個(gè)HCO3-離子擁有6 個(gè)可與Fe3+結(jié)合的配位鍵，從而形成了2 個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)。OVT 蛋白與HCO3-以及Fe3+相互結(jié)合后會(huì)使整個(gè)蛋白分子結(jié)構(gòu)變得更緊密、封閉、穩(wěn)定，并且提高了其對(duì)乙醇沉淀作用的耐受性。

方法1.3.4 先形成了OVT-HCO3－-Fe3+三元復(fù)合體，后在43%乙醇濃度下，稀釋后的蛋清液中幾乎除了OVT 蛋白的其他蛋白都會(huì)沉淀，經(jīng)4 ℃離心（3 220×g，20 min）后可除去大部分除了轉(zhuǎn)鐵蛋白雜蛋白，而大部分形成三元復(fù)合體的OVT 則存在于呈亮橙紅色的上清液中，但當(dāng)乙醇終濃度到了59%時(shí)，溶液中橙紅色物質(zhì)，即OVT 三元復(fù)合體會(huì)發(fā)生沉淀，沉淀再用去離子水復(fù)溶成為亮橙紅色溶液，調(diào)節(jié)此溶液pH 至4.7，此時(shí)三元復(fù)合體在酸性條件下穩(wěn)定性下降，HCO3-和Fe3+會(huì)游離出來(lái)，溶液顏色會(huì)由亮橙紅色逐漸變?yōu)槿榘咨?，再加入陰離子交換樹(shù)脂并經(jīng)攪拌，HCO3-被陰離子交換樹(shù)脂吸附，經(jīng)過(guò)濾后，結(jié)合了HCO3-的樹(shù)脂可被除去，此時(shí)，脫輔基蛋白就不會(huì)再結(jié)合Fe3+。得到溶液經(jīng)透析，凍干，得到脫輔基的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白。SDS-PAGE電泳得到的電泳圖如圖1 所示。表明，此時(shí)蛋白的純度較高，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)的軟件分析表明該蛋白的純度高于96%。

注：5%濃縮膠、12%分離膠；A 電泳道為Marker（PageRuler Prestained Protein Ladder#Sm0672，F(xiàn)ermentas 公司），上樣量5 μL；B 和C 電泳道分別為2 次提取的OVT 樣品，濃度為1 mg/mL、上樣量10 μL。

注：a 圖中，層析柱：2.0 cm×4 cm、平衡緩沖液：pH5.2，0.05 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、流速：1 mL/min、洗脫液：0.05 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH5.2 并含0.5 mol/L NaCl；b 圖中，A 電泳道為組分1的圖譜，B 電泳道為組分2 的圖譜，C 電泳道為蛋白質(zhì)marker。

從電泳圖譜的結(jié)果來(lái)看，由方法1.3.4 提取的OVT 蛋白粗品仍含有其他蛋白質(zhì)，特別是分子量在72 ku～34 ku 范圍內(nèi)的其他蛋白。

2.2 兩步弱酸性陽(yáng)離子交換層析進(jìn)一步純化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)果

第一步弱酸性陽(yáng)離子交換層析過(guò)程如圖2a 所示，峰1 處所收集的蛋白液含有OVT 蛋白的組分1，峰2處所收集的為含有溶菌酶以及抗生素蛋白的組分2，經(jīng)SDS-PAGE 電泳的檢測(cè)結(jié)果如圖2b 所示，經(jīng)過(guò)這一步離子交換步驟，可有效地將等電點(diǎn)≥8.0 雜蛋白從樣液中除去。

3 結(jié)論

雞蛋原蛋清經(jīng)過(guò)蛋清預(yù)處理后可以得到“無(wú)黏蛋白”被稀釋的蛋清液，再經(jīng)過(guò)兩步醇析法可以得到純度較高的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，最后的兩步弱酸性陽(yáng)離子層析法以及相應(yīng)的冷凍干燥可是得到純度高于96%的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品。

注：a 圖中，層析柱：2.0 cm×4 cm、平衡緩沖液：pH8.0，0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液、流速：1 ml/min、洗脫液：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液pH8.0 并含0.5 mol/LNaCl；b 圖中，A 電泳道為組分1 圖譜，B 電泳道為組分2圖譜。

第二步弱酸性陽(yáng)離子交換層析過(guò)程如圖3 所示，峰1 處所收集的組分1 蛋白液所含的大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)小于pH5.2，而峰2 處所收集的組分2 蛋白液為OVT 蛋白組分，經(jīng)SDS-PAGE 電泳的檢測(cè)結(jié)果如圖2b 所示，經(jīng)過(guò)第二步離子交換后，B 電泳道的圖譜

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