孫崇魯

（浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，浙江寧波315100）

樟樹(shù)系樟樹(shù)屬的常綠喬木植物，是我國(guó)亞熱帶綠闊葉林的主要樹(shù)種之一，它在我國(guó)資源豐富。樟樹(shù)具有驅(qū)蟲(chóng)、防腐耐蛀的功能。樟樹(shù)葉有提取色素、香料等用來(lái)制成植物農(nóng)藥，制備氧化劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等。且樟樹(shù)葉為可再生資源，其應(yīng)用前景廣闊[1]。植物中葉綠素含量是植物生理生化及生態(tài)調(diào)查中的一個(gè)重要測(cè)量參數(shù)，它不僅是表達(dá)植物生物量的一個(gè)指標(biāo)，也是檢測(cè)植物健康程度及環(huán)境因子的關(guān)鍵指標(biāo)[2]。葉綠素作為一種天然色素廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)[3-5]，隨著人們生活水平的提高，對(duì)天然色素的需求量也日趨增長(zhǎng)。本試驗(yàn)對(duì)香樟葉葉綠素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究，旨在為香樟葉葉綠素的提取和香樟葉綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 主要儀器與試劑

UVmini-1240 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津（中國(guó)）有限公司，香樟葉采自浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校校內(nèi)，丙酮、乙醚、乙醇、石油醚、氯仿、甲醇、抗壞血酸等均為分析純。

2 方法

2.1 葉綠素提取的工藝流程[6-7]

香樟葉→洗凈→吸干表面水分→剪碎→稱(chēng)量→浸提→離心→測(cè)吸光度值

2.2 單因素試驗(yàn)

[8-9]的方法，分別對(duì)香樟葉葉綠素提取過(guò)程中所用的提取劑、提取劑濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)

據(jù)香樟葉葉綠素提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)料液比、溫度、提取時(shí)間進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，以確定浸提葉綠素的優(yōu)化條件。

2.4 香樟葉葉綠素穩(wěn)定性的研究[10-12]

取一定量的香樟葉葉綠素提取液，稀釋10 倍，分別在不同條件下處理后，測(cè)定波長(zhǎng)665 nm 處的吸光度值，分析不同因素對(duì)香樟葉葉綠素穩(wěn)定性的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素對(duì)香樟葉葉綠素提取效果的影響

3.1.1 浸提溶劑的選擇

稱(chēng)取香樟葉5 g，以甲醇、95%乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、乙醇：丙酮=1 ∶1、石油醚等7 種溶劑為提取劑，料液比1 ∶50（g/mL）于常溫條件下分別浸提1 d，量取1 mL 提取液于10 mL 的容量瓶中，定容后，于波長(zhǎng)665 nm 處測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 溶劑對(duì)香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

由圖1 可以看出，除了氯仿、石油醚外，其余提取劑對(duì)香樟葉葉綠素的提取率都較高，最高的是混合溶劑。故試驗(yàn)采用無(wú)水乙醇：丙酮=1 ∶1 混合溶劑作為提取劑。

3.1.2 提取劑濃度的選擇

稱(chēng)取香樟葉5 g，分別用無(wú)水乙醇：丙酮=4 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶4 及丙酮和無(wú)水乙醇為提取劑，料液比1 ∶50（g/mL），于常溫條件下分別浸提1 d。，量1 mL 取液于10 mL 的容量瓶中，定容后，于波長(zhǎng)665 nm 處測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 混合溶劑配比對(duì)香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.2 Effects of different ratio of mixed solvents on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

可以看出，無(wú)水乙醇∶丙酮=1 ∶1 時(shí)，提取效果較好。

3.1.3 料液比的選擇

稱(chēng)取香樟葉5 g，以無(wú)水乙醇∶丙酮=1∶1 為提取劑，料液比分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g：mL）于常溫條件下分別浸提1 d，量取0.5 mL 提取液于10 mL的容量瓶中，定容后，于波長(zhǎng)665 nm 處測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.3 Effects of the ratio of material to liquid on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camplora leaves

由圖3 可以看出，料液比為1 ∶6（g/mL）時(shí)，提取效果優(yōu)于其他情況。

3.1.4 提取溫度的選擇

稱(chēng)取香樟葉5 g，以無(wú)水乙醇：丙酮=1 ∶1 為提取劑，料液比分別為1 ∶6（g/mL），分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃加熱回流提取2 h，提取液定容后，于波長(zhǎng)665 nm 處測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

由圖4 可以看出，30 ℃～70 ℃時(shí)提取液吸光度值明顯增大，但當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃以后，提取液吸光度值開(kāi)始下降，可能和葉綠素本身的熱穩(wěn)定性有關(guān)。選定70 ℃作為進(jìn)一步研究的溫度條件。

3.1.5 提取時(shí)間的選擇

稱(chēng)取香樟葉5 g，以選定的溶劑、料液比，在70 ℃分別浸提1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，提取液定容后，于波長(zhǎng)665 nm 處測(cè)吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5 可以看出，提取時(shí)間為2.0 h 時(shí)，提取效果最好。

3.2 正交試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)，確定正交試驗(yàn)因素水平，見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 可知，3 個(gè)因素影響次序是B＞C＞A，優(yōu)化提取工藝是A3B2C2，料液比1 ∶6（g/mL）、溫度60 ℃、提取時(shí)間4.0 h。按A3B3C2進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得平均吸光度值為1.609。

圖5 提取時(shí)間對(duì)香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.5 Effects of time on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 優(yōu)化提取條件L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test of optimization of extraction conditions

3.3 香樟葉葉綠素的穩(wěn)定性研究

3.3.1 光照對(duì)香樟葉葉綠素穩(wěn)定性的影響

取經(jīng)10 倍稀釋的葉綠素提取液，于太陽(yáng)光下分別照射1、2、3、4、5、6 h 后測(cè)定其吸光度值。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 表明，隨著葉綠素在自然光條件下暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，葉綠素提取液的吸光度值在持續(xù)下降，當(dāng)光照4h 時(shí)，葉綠素吸光度值下降為0.201，而后4 h 吸光度值變化很小，至6 h 時(shí)，吸光度值為0.184。

3.3.2 溫度對(duì)香樟葉葉綠素穩(wěn)定性的影響

取葉綠素提取液置于75 ℃～95 ℃的水浴鍋中溫育1 h，冷卻后測(cè)定其吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖6 光照對(duì)香樟葉葉綠素的影響Fig.6 Effects of light on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

表3 溫度對(duì)荷葉葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of temperature on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

表明，葉綠素在85 ℃前吸光度值明顯減小，但85 ℃溫育后其吸光度值降低幅度不大，即香樟葉葉綠素具有一定耐高溫性。

3.3.3 pH 對(duì)香樟葉葉綠素穩(wěn)定性的影響

取葉綠素提取液，調(diào)節(jié)提取液的pH 分別為1、3、5、7、9、11、13，測(cè)定其吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 pH 值對(duì)香樟葉葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH value on stability of chlorophyll

表明，隨著pH 的增加，香樟葉葉綠素的吸光度值也在增加，當(dāng)pH≥7 時(shí)，其吸光度明顯下降，即pH 對(duì)香樟葉葉綠素的穩(wěn)定性影響較大。

3.3.4 香樟葉葉綠素的耐氧化性和耐還原性

取定容后的葉綠素提取液10 mL，分別加入5%的抗壞血酸溶液、5%的過(guò)氧化氫溶液1mL，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 氧化還原劑對(duì)葉綠素的影響Table 4 Effects of oxidizer and reducer on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

加入5%抗壞血酸使綠色略微變淺，其吸光度值略微下降。但加入5%過(guò)氧化氫使綠色明顯變暗，其吸光度值明顯下降。因此，香樟葉葉綠素耐還原性較好，但氧化劑對(duì)其穩(wěn)定性有一定影響。

3.3.5 金屬離子對(duì)葉綠素穩(wěn)定性的影響

取葉綠素提取液，分別加入濃度為1 mg/mL 的Al3+、Zn2+、Na+、Fe3+、Ca2+、Cu2+和Mg2+，觀察葉綠素溶液顏色變化，1h 后測(cè)定其吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 金屬離子對(duì)荷葉葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 5 Effects of metal ion on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

Ca2+、K+、Na+、Cu2+、Pb2+、Zn2+對(duì)該葉綠素?zé)o明顯影響，F(xiàn)e3+對(duì)葉綠素的影響較大，使溶液變?yōu)楹谏?/p>

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)香樟葉葉綠素提取條件的研究，得出香樟葉葉綠素提取的優(yōu)化工藝是以乙醇：丙酮=1 ∶1 為提取劑，料液比1 ∶6（g/mL），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間4.0 h。優(yōu)化工藝下香樟葉葉綠素吸光度值為1.609。對(duì)香樟葉葉綠素的穩(wěn)定性研究表明，光照影響香樟葉葉綠素的穩(wěn)定性，當(dāng)光照時(shí)間達(dá)4h 時(shí)，葉綠素吸光度值急劇下降；葉綠素在85 ℃前吸光度值明顯減小，但85 ℃后其吸光度值降低幅度不大，即香樟葉葉綠素具有一定耐高溫性；pH 對(duì)香樟葉葉綠素的穩(wěn)定性影響較大，隨著pH 的增加，香樟葉葉綠素的吸光度值也在增加，當(dāng)pH≥7 時(shí)，其吸光度明顯下降；香樟葉葉綠素耐還原性較好，但氧化劑對(duì)其穩(wěn)定性有一定影響；Ca2+、K+、Na+、Cu2+、Pb2+、Zn2+對(duì)該葉綠素?zé)o明顯影響，F(xiàn)e3+對(duì)葉綠素的影響較大。因此在香樟葉葉綠素的提取、加工處理、儲(chǔ)存和使用過(guò)程中，應(yīng)盡可能在避光、低溫、中性條件下進(jìn)行，防止H2O2、抗壞血酸、Fe3+等的不良影響。可考慮制備相應(yīng)的鹽類(lèi)以提高其穩(wěn)定性。

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