孔 瓊， 楊紅玉， 王云月， 霍 達， 胡海林， 劉振華， 秦麗娟

（1.云南農業(yè)大學植物保護學院，生物多樣性與病害控制教育部重點實驗室，昆明 650201；2.紅河學院生物系，蒙自 661100；3.昆明學院生命科學與技術系，昆明 650214）

細胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）是指動、植物特定或局部細胞在一定的發(fā)育時期或外界作用下，為了自身發(fā)育或抵抗外界不良環(huán)境，在自身基因控制下采取的主動有序的死亡方式。PCD在導管分化、胚柄退化、單性花形成等［1］生物體的正常生長發(fā)育及植物抗病反應等生命活動中是不可缺少的組成部分。由病原物侵染引起的PCD現象早在20世紀20年代就有報道［2］，此后許多學者對植物與病原菌互作中的PCD進行了廣泛和深入的研究，本文主要就植物PCD概念、檢測方法、植物與病原互作中PCD及調控機理等方面進行綜述。

1 植物PCD、壞死及過敏反應

植物－病原物互作過程中可產生細胞程序化死亡和壞死兩種反應，前者是植物對病原物侵染等外界刺激發(fā)生的主動抗性反應，后者是一種被動過程，其誘因主要表現為誘導因子的激烈程度，區(qū)別在于細胞形態(tài)變化、細胞膜的完整性、是否有凋亡小體產生等。

過敏反應（hypersensitive reaction，HR）是植物－病原物非親和互作過程中發(fā)生的一種快速抗病反應，常在病原物侵染點周圍出現植物組織的迅速死亡，限制病原物的進一步擴展，產生局部抗性，同時還可誘導植物啟動基礎防御機制，防止病原物的進一步侵染。許多研究表明，HR是一種主動反應，通常被認為是PCD的表現形式［3－6］。

2 PCD特征及檢測方法

研究表明，植物PCD與動物細胞凋亡有很多相似特征［6－8］，即形態(tài)表現為細胞質和細胞核濃縮、染色質邊緣化，隨后由膜包圍DNA片段而形成凋亡小體，線粒體產生空泡和解體，液泡裂解或融合，內質網膨大，形成自體吞噬泡；生化表現為核DNA被誘導產生核酸內切酶降解斷裂成帶有3′－OH末端和大小不同的寡聚核小體片段，并于瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到180～200bp倍增的DNA“梯形”條帶；遺傳上表現為需要特定基因的轉錄和蛋白質合成，并可被特定基因的表達所抑制。植物PCD一般根據細胞的形態(tài)學、生物化學和分子生物學特點進行檢測。形態(tài)學是鑒定PCD最直接的方法，通過苔盼藍（trypan blue）或伊文思藍（evans blue）等對細胞或組織染色后，借助光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；也可用 DAPI（4，6－diamidino－2－phenylindole即4，6－二脒基－2－苯基吲哚）、PI（propidium iodide，碘化丙啶）、EB（ethidium bromide，溴化乙錠）、AO（acridine orange，吖啶橙）等熒光染料染色觀察細胞核的變化、液泡解體或凋亡小體的形成等，為植物PCD過程提供細胞學證據。生理生化法主要檢測PCD過程中的系列生化變化，可利用瓊脂糖凝膠電泳、彗星電泳、流式細胞計數、原位DNA標記檢測（TUNEL法）和酶聯免疫等方法檢測DNA斷裂及半胱氨酸酶活性等。分子生物學法主要用來監(jiān)測與PCD有關的特定基因轉錄或表達變化，以確定寄主植物或病原菌是否發(fā)生PCD。與PCD有關的基因包括稻瘟菌自噬基因MgATG8、擬南芥執(zhí)行細胞死亡的AtMC9、直接調控細胞程序化死亡的基因VASCULAR－RELATED NACDOMAIN6 或 抗 凋亡基因BI－1［9－12］等。

3 植物與病原互作中的PCD

據文獻報道真菌、細菌、病毒和線蟲植物病原都能引起寄主植物出現PCD，并且其中一些病原物的胞內或胞外代謝產物也能造成植物呈現PCD。

3.1 真菌引起的PCD

早在1923年，Allen［2］將小麥稈銹菌（Puccinia graminis f.sp.tritici）滲透到小麥體內，寄主細胞表現細胞核形狀改變、液泡消失等現象，因此作者推測該菌可能釋放了一種引起寄主細胞改變的物質，然后寄主細胞也釋放一種物質殺死真菌，最后造成寄主發(fā)生PCD。白志英［13］對小麥與葉銹菌（P.reconditaf.sp.tritici）互作過程中小麥葉肉細胞進行觀察，發(fā)現在小麥與葉銹菌不親和互作過程中發(fā)生的HR屬于PCD。有研究者［14］根據TUNEL染色發(fā)現，豇豆受到銹菌侵染時發(fā)生HR的早期事件之一是細胞質停止流動，并伴隨著原生質體分解和核酸內切酶解裂。近期在橢圓葡萄孢［Botrytis elliptica（Berk.）Cooke］與百合葉片互作研究中發(fā)現，該菌能誘導百合葉片細胞出現典型的PCD特征，即原生質濃縮、DNA片段化和NO、H2O2累積等，并發(fā)現該過程由磷酸激酶途徑所介導［15］。有研究報道小麥白粉菌（Blumeria graminis f.sp.tritici）與小麥根系互作過程中也出現PCD，并且ROS和Ca2＋參與了該過程［16］。表明PCD在植物－病原真菌互作過程中普遍存在。

3.2 細菌引起的PCD

Barlow［17］于1982年報道了由細菌引起的PCD最初的一個特征是寄主細胞膜透性增強。Wakabayashi［18］等人研究發(fā)現被丁 香 假 單 胞菌 （Pseudomonas syringae Van hall）無毒株侵染的萵苣葉片中線粒體出現腫脹，類似于動物細胞凋亡，并伴隨有細胞質空泡化和濃縮等現象；而當用一株無毒丁香假單胞菌（P.syringae）菌株與擬南芥葉片互作時，也發(fā)現有類似細胞凋亡小體的形成［19］。

3.3 病毒引起的PCD

當含N基因的煙草受到煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）侵染時，可引起煙草出現PCD現象［20］。研究發(fā)現，在PCD發(fā)生時，煙草細胞的液泡降解，液泡蛋白酶（vacuolar processing enzymes，VPEs）抑制劑通過抑制這一過程而阻礙PCD的發(fā)生。在液泡降解后，細胞中的細胞質和許多細胞器仍然存在，說明細胞中的液泡與細胞質組分的降解無關。但在TMV與番茄互作的研究［21］中發(fā)現，在番茄的非接種部位如根尖和莖尖出現了典型的PCD特征，即細胞核的TUNEL檢測呈陽性；DNA電泳檢測出梯形條帶；線粒體結構破壞；液泡膜和質膜收縮和降解等，說明被病毒局部侵染的葉片可誘發(fā)同株植物的根尖和莖尖獲得系統(tǒng)性PCD反應。

3.4 線蟲引起的PCD

關于線蟲引起的植物PCD現象，研究報道較少。厲艷［22］在研究松材線蟲與松樹互作時，發(fā)現在松材線蟲侵染早期，寄主植物薄壁細胞出現PCD，具體表現為細胞核凝縮變形，染色質濃縮并在核膜下呈新月形聚集，細胞核斷裂并形成碎片，形態(tài)不規(guī)整，分散分布直至最后瓦解。同時還發(fā)現當用線蟲接種松苗后，在線蟲未到達的莖段組織細胞中也出現了不同程度的PCD，研究者認為皮層薄壁細胞發(fā)生PCD的數量和程度隨著時間的推移和線蟲在松苗體內不斷擴散分布而逐步增加。該研究首次確認了松樹線蟲病發(fā)生過程中伴隨著寄主細胞的PCD。

3.5 毒素和激發(fā)子引起的PCD

一些病原真菌產生的毒素也會引起寄主植物發(fā)生PCD現象，研究較多的是鏈格孢（Alternaria）、灰葡萄孢（Botrytis）和馬鈴薯瘡痂病菌［Streptomyces scabiei（ex Thaxter）Lambert et Loria］。當將一定濃度的毒素滲透到植物葉片、懸浮培養(yǎng)的細胞或原生質體中時，可觀察到植物PCD現象，如線粒體跨膜勢能的降低；DNA梯形條帶；細胞核分裂，但質膜和液泡膜仍保持完整；TUNEL反應陽性和凋亡小體產 生［7－8，23］。Elena 等［24］發(fā) 現 煙 草 赤 星 病 菌 ［A.alternata（Fr.：Fr.）Keissler］分泌的 AT 毒素與煙草葉片互作中存在典型的PCD現象，并且ROS信號轉導途徑在誘導PCD中起著重要作用。

另外，植物病原真菌產生的寡糖、糖蛋白、四烯酸、蛋白質和多肽等分子，作為激發(fā)子可誘發(fā)寄主植物發(fā)生防衛(wèi)反應和細胞死亡。其中用隱地疫霉（Phytophthora cryptogea Pethybridge et Lofferty）分泌的隱地蛋白（cryptogein）處理煙草細胞，觀察到PCD的發(fā)生，細胞質濃縮，細胞核濃縮裂解，DNA片段化及凋亡小體形成等［25］。Sasabe等［26］發(fā)現致病疫霉［P.infestans（Montagne）de Bary］分泌的elicitin INF1可以誘導煙草懸浮細胞發(fā)生死亡并檢測到DNA片段化，處理后的1～3h內PAL（phenylalanine ammonla－lyase）防衛(wèi)基因表達且 H2O2累積；有學者［27］研究表明，當用灰霉菌（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）的激發(fā)子處理擬南芥懸浮細胞時，其細胞在死亡的同時伴有H2O2和茉莉酸的產生，同時苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）、查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）的活性增強。而Erin和 Alex［28］則發(fā)現嗜腐菌能誘導擬南芥出現HR反應。同時細菌hpr基因編碼的蛋白激發(fā)子Harpin也可以誘導煙草懸浮細胞［29］出現典型的PCD現象。

4 PCD的調控機理

4.1 信號轉導

4.1.1 活性氧

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）被認為與植物過敏性反應和系統(tǒng)獲得抗性相關，是調控防衛(wèi)反應的重要因子［30］。在病原物與寄主互作而發(fā)生PCD的早期，植物通過消耗分子氧而瞬時產生ROS，即發(fā)生氧爆發(fā)［31］，這種氧爆發(fā)往往存在于抗性植物，常見的ROS包括超氧陰離子（O－2）、羥自由基（OH－）和過氧化氫（H2O2）等。大量研究發(fā)現，凡能影響ROS代謝進而調節(jié)細胞內ROS水平的因素均與植物PCD有關。Mittler［32］等發(fā)現，用丁香假單胞菌菜豆致病變種（Pseudomonas syringae pv.phaseolicola Young）和煙草花葉病毒（TMV）分別感染煙草葉片時，在低氧條件下PCD的發(fā)生受到抑制，同時抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和Cu－Zn超氧化物歧化酶（Cu－Zn SOD）等轉錄增加，膜脂過氧化也同時增加，表明在HR反應過程中的確存在活性氧的生成。當將反義過氧化氫酶（catalase，CAT）和反義APX基因轉入煙草植株后，轉基因植物的CAT和APX含量下降，同時觀察到在病原菌侵染下轉基因植株較野生型更容易發(fā)生PCD，證明了病菌誘發(fā)的PCD與ROS有關［33］。

NO也屬于ROS中的一類，在HR中同時參與PCD和系統(tǒng)獲得抗性［34］。當用疫霉菌接種馬鈴薯葉片時，空白對照的葉片中葉綠素含量明顯下降，而經NO發(fā)生劑硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）處理的葉片葉綠素濃度無明顯變化，且明顯地減輕感病所導致的細胞膜離子滲漏及細胞核DNA的斷裂［35］。Delledonne［36］等人研究發(fā)現接種無毒大豆假單胞菌［P.syringae pv.maculicola（McCulloch）Young，Dye et Wilkie］能誘導大豆產生PCD現象，并伴隨 NO產生，NOS抑制劑（nitro L arginine methyl ester，L－NAME）能抑制擬南芥過敏性細胞死亡。在NO或無毒病原菌介導的過敏性細胞死亡中，半胱氨酸蛋白酶抑制子AtCYS1能被誘導，并且該基因的過量表達又會抑制擬南芥懸浮細胞和轉基因煙草中病原體和活性氧引起的細胞死亡，表明半胱氨酸蛋白酶和其抑制子在由NO介導的PCD中起著關鍵作用［37］。

4.1.2 水楊酸（salicylic acid，SA）

SA是植物抗病防衛(wèi)反應的一種重要信號分子，同時也參與植物PCD調控。有研究顯示，當用TMV處理煙草時，侵染點周圍細胞中的SA含量急劇上升［38］，ROS也協同增加，導致了PCD和獲得了系統(tǒng)防衛(wèi)。SA積累能清除下游ROS自由基，同時有助于增加植物與病原物識別過程中產生的大量ROS［30］。外源SA既可誘導由大豆細菌性斑點病菌（P.syringae pv.glycinea）引起的R基因控制的大豆細胞培養(yǎng)中死亡［14］，又可調控臭氧（O3）脅迫誘導的HR細胞死亡［39］。水楊酸水解酶基因（NahG）產物可降低細胞內源SA含量，含有NahG基因的煙草和擬南芥在病毒侵染和臭氧脅迫下不表現HR，而其相應的野生型植株則表現HR，表明SA對植物 PCD 有重要調控作用［40－41］。

4.1.3 Ca2＋

Ca2＋是一種胞內信號分子，廣泛分布于植物細胞壁、細胞核、內質網、線粒體及細胞質中，該信號主要發(fā)生于ROS產生的下游［42］。已有研究報道，Ca2＋參與了多種植物PCD過程，如殼聚糖誘導的大豆細胞PCD［43］，馬鈴薯瘡痂病菌［Streptomyces scabiei（ex Thaxter）Lambert et Loria］分泌的thaxtomin A毒素引起的擬南芥PCD與Ca2＋的細胞內流增加相關［44］。液泡破裂是許多植物發(fā)生PCD的重要表現，其膜破壞則與細胞Ca2＋濃度有關。植物細胞在病原菌侵染后，Ca2＋內流，從而增加了胞內鈣水平，結果引起液泡破裂；細胞質流動變慢，并且減速的胞質流在液泡崩潰前停止，而該過程可被鈣螯合劑和鈣離子通道阻斷劑如岡田酸（okadaic acid，OA）所抑制。

4.2 相關蛋白酶

細胞解體是PCD的最終環(huán)節(jié)，已知該過程由很多蛋白水解酶共同協作完成。已在植物中發(fā)現多種與動物細胞凋亡功能相似的半胱氨酸蛋白酶類，如VPEs（液泡蛋白酶）、metacaspases（胱天蛋白酶）和saspases（絲 氨 酸 內 肽 酶 ）等［45－46］。 研 究 發(fā) 現，在TMV感染的煙草葉片發(fā)生PCD過程時，VPEs表現出類似caspase－1的活性；當用TMV感染VPEs發(fā)生沉默的煙草時，被感染葉片上沒有可見的損傷，而類caspase－1活性的減少量則與VPEs的減少量成正比關系［20］，表明液泡蛋白酶（VPEs）參與了由TMV引起的PCD。Watanabe和Lam［47］研究發(fā)現，AtMCP1b和AtMCP2b（metacaspases類）的活性能夠被半胱氨酸酶抑制劑（zVAD－fmk）所抑制，且兩者的表達激活了植物PCD過程。同時在灰霉菌（B.cinerea）誘導的番茄細胞死亡中，發(fā)現LeMCA1（metacaspase類）的轉錄水平迅速提高，而LeMCA1轉錄水平在由喜樹堿（camptothecin）或伏馬菌素（fumonisin B1）誘導的懸浮細胞死亡過程中卻保持不變［48］，表明不是所有的細胞死亡過程都伴隨著同一種酶的轉錄增強。有研究表明具有caspase活性的saspase－1和saspase－2可被caspases酶特異性抑制劑 Ac－VAD－CMK（caspase－1抑制劑）所抑制，并可以水解多種caspases酶的特異性底物。這兩種酶在由維多利亞旋孢腔菌（Cochliobolus victoriae Nelson）產生的Victorin毒素誘導燕麥產生PCD過程中起重要作用，其原因有可能是由于saspase被釋放到細胞外液，從而激活了PCD［49］。

4.3 相關基因

與PCD直接相關的基因報道較少，目前研究較為深入的有大麥mlo基因，擬南芥AtMYB30轉錄因子等［51－52］。大麥mlo基因賦予植物廣譜高效抗病性［50］，對大麥抗白粉病的作用尤為突出。研究認為，mlo基因在植物細胞凋亡過程中起負調控作用，在其隱性功能喪失的突變品種中，白粉病侵染的細胞不發(fā)生過敏性反應，而是以局部細胞壁沉積加厚的方式來抵抗病原菌，即對初期侵染的病原菌具有強烈的結構抗性，導致病原菌不能成功侵染大麥表皮細胞［51］。Fabienne等［52］從擬南芥中克隆了與PCD相關的AtMYB30轉錄因子，并發(fā)現AtMYB30的過量表達能加速和增強對病原菌的抗性，在病原菌入 侵 時 誘 導 類 似 HR 的 反應。Liu等［53］對RRP46（rRNA加工蛋白）轉錄因子的功能進行了研究，發(fā)現大麥與白粉菌互作中，該轉錄因子引發(fā)了病原菌侵染的寄主細胞死亡中RNA加工和降解。另外從番茄中獲得的抗病基因PTO編碼一類絲／蘇氨酸蛋白酶，將其PTI序列導入煙草后能加速產生HR［54］，表明該基因參與了PCD的發(fā)生過程。

5 結語

目前關于植物與病原互作過程PCD的許多機制仍不清楚，但有關植物和真菌細胞凋亡或死亡的相關基因、活性氧信號傳導、與細胞死亡有關的分子互作機制等方面已有較多研究，并得到了許多有意義的結果，從細胞學和分子生物學角度揭示了病害發(fā)生機制和植物的抗病機理，對病害的有效控制和抗病品種選育具有重要的實際應用意義。

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