陳振文 谷龍杰

1.國家人口計生委科學技術研究所(北京，100081);2.華中科技大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心

精液分析是評估男子生育力的重要方法，也是男科疾病診斷以及療效觀察的試驗依據(jù)。精液常規(guī)分析易受采集方式、射精頻度、溫度、實驗室條件、檢驗人員的技術熟練程度及主觀判斷能力等諸多因素的影響，導致分析結果發(fā)生偏差，所以精液的采集與分析必須嚴格按照標準化程序進行，才能提供受檢者臨床狀況的必要信息。近年來隨著男科學和生殖醫(yī)學的快速發(fā)展，不少原有的概念和診療建議需要修訂，為此WHO組織成立了專門的委員會，通過收集臨床數(shù)據(jù)，修訂出版了新的《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)，以期提高精液分析質量。

1 精液標本的采集和運送

精液采集規(guī)范化是做好精液分析的前提條件，因此在精液采集前務必詳細告知受檢者有關精液采集和運送的方法及注意事項。

1.1 精液采集次數(shù)

不育夫婦初診時，男方應至少檢測2～3次精液標本以獲取基線數(shù)據(jù)，兩次精液采集的時間應間隔7d～3周。如果兩次精液分析的結果有明顯差異，應再采集標本進行第3次分析。

1.2 精液采集時間

最好在實驗室附近的私密的房間內進行，采集前應禁欲至少2d，最多7d。如果需要多次采集標本，每次的禁欲天數(shù)應盡可能一致，以減少精液分析結果的波動。每一份精液分析報告都應寫明:受檢者姓名、禁欲天數(shù)、標本采集的日期和時間、標本采集是否完整以及標本從采集到分析的時間間隔等。

1.3 精液采集及保存運送

最好采用手淫法采集精液，將精液收集于對精子無毒性的清潔廣口玻璃或塑料容器中。如果要做微生物學檢查或用于輔助生殖治療，受檢者應提前排尿并洗凈雙手和陰莖，用無菌容器收集精液。特殊情況下可采用特制的對精子無毒性的避孕套進行精液采集，并于采集后1h內送到實驗室。如果在家里或其他場所采集精液，在運送到實驗室期間應保持溫度恒定在20～37℃，并予以記錄。精液采集一定要完整，不完整的精液不宜進行分析。

1.4 無菌處理

精液標本可能含有致病菌和病毒，應視為生物危險品。實驗室技術人員要注意防護，使用一次性手套和器皿。用過的器皿要消毒處理。對用于精液培養(yǎng)、生物測定、宮腔內人工授精或體外受精的標本，在處理過程中必須嚴格使用無菌材料和無菌操作。

2 精液的肉眼觀察

2.1 精液的液化

精液射出后會很快呈現(xiàn)半固體凝膠的外觀，通常在數(shù)分鐘內開始液化變得稀薄，液化大多在15min內完成，如超過60min未能完全液化應作記錄。正常液化的精液中可能含有不液化的膠凍狀顆粒，這一現(xiàn)象沒有臨床意義。對液化不良的精液標本，可用機械混勻或酶消化(菠蘿蛋白酶10U/L)的方法進行處理，也可以采用在標本中加入等體積的培養(yǎng)液并用加樣器反復吹打的方法。應注意的是，所有這些處理方法可能影響精漿的生化、精子活力和精子形態(tài)學的測定結果，必須予以記錄。

2.2 精液黏稠度

精液液化后，將精液吸入一支廣口徑(直徑1.5mm)的一次性塑料吸液管，使精液借助重力滴下，觀察拉絲的長度，可以評估精液標本的黏稠度。正常精液會形成不連續(xù)的小滴;黏稠度異常時液滴會形成超過2cm的拉絲。另一個檢查方法是將一根玻璃棒插入精液，提起玻璃棒，觀察拉絲長度。拉絲長度超過2cm應記錄為異常的黏稠度。過高的精液黏稠度可干擾精子活力、濃度、精子表面抗體和生化標志物的檢測。

2.3 精液的外觀

正常的精液質地均勻、呈灰白色，禁欲時間長時精液可略帶黃色。如果精子濃度非常低或無精子，精液可能顯得透明些。含有紅細胞的精液可呈紅褐色。如有黃疸或服用某些維生素，精液可呈黃色。

2.4 精液的體積

第5版手冊強調精確測量精液體積的重要性。推薦采用稱重的方法計算精液的體積:預先測定空容器的重量，采集精液后再次稱重，減去原始重量得到的差值即為精液的重量，再除以精液比重就可計算精液的體積，精液的實際比重約為1.014g/ml，實際工作中可用1g/ml替代;此外也可以將精液收集在廣口帶刻度量筒中直接讀取精液體積。不推薦采用將容器中的精液轉移到量筒或注射器中測定精液體積的方法，以免低估精液體積。正常男子每次射精量≥1.5ml。在沒有精液丟失的前提下，如果精液體積過少，應考慮先天性雙側輸精管缺如、射精管梗阻、不完全逆行射精以及雄激素缺乏等可能性。

2.5 精液的pH值

精液pH值反映了不同附性腺分泌液pH值之間的平衡，應在射精后同一時間測量，最好是30min后，但不超過1h。將精液標本混勻后，在pH試紙上(測試范圍6.0～10.0)均勻地涂上一滴精液，等浸漬區(qū)顏色均勻后(30s內)立即與標準條帶顏色對比，讀出pH值。

3 精液的顯微鏡檢查

精液顯微鏡檢查包括精子濃度、精子活力、精子存活率、精子凝集、非精子細胞成分的測定和精子的形態(tài)學分析。建議使用相差顯微鏡進行新鮮精液未染色制片的所有檢查。

3.1 濕片的制備

精液取樣的體積和蓋玻片的尺寸應標準化，以使精液在20μm左右的厚度下進行分析。具體方法是:混勻精液后，立即將10μl的精液滴在干凈載玻片上，蓋上22mm×22mm的蓋玻片。蓋玻片的重量使標本散開，注意避免在蓋玻片和載玻片之間產生氣泡。等制片內精液不再漂移立即進行評估。由于溫度會影響精子的活力分級，因此實驗室的溫度必須標準化，檢測宜在20～24℃室溫下進行。制備好的標本應先在100倍鏡下觀察是否有黏液絲形成，精子的聚集或凝集，除精子外的其他細胞以及標本在載玻片上展開的是否均勻，然后在200或400倍鏡下評估精子活力，并確定檢測精子濃度所需的精液稀釋倍數(shù)。

3.2 精子凝集與聚集

精子聚集是指不活動精子之間，活動精子與黏液絲，活動精子與非精子細胞成分或細胞碎片等粘在一起，應如實記錄。精子凝集是指活動精子以頭對頭、尾對尾或混合型相互粘在一起，提示可能存在抗精子抗體。應記錄所有活動精子的凝集類型，凝集的程度分為1、2、3、4級:每個凝集少于10個精子，有很多自由活動精子為1級;每個凝集有10～50個精子，存在自由活動精子為2級;每個凝集多于50個精子，仍有一些自由活動精子為3級;所有精子凝集，數(shù)個凝集粘連在一起為4級。根據(jù)粘連部位分為A、B、C、D、E級:A級為頭對頭;B級為尾對尾;C級為尾尖對尾尖;D級為混合型，可以清晰看到頭對頭和尾對尾的凝集;E級為頭和尾的纏結、無法清晰看到頭部的凝集。

3.3 非精子細胞成分

精液中含有非精子細胞成分，包括泌尿生殖道的上皮細胞、生精細胞和白細胞等，后兩者統(tǒng)稱為“圓細胞”。一般而言，一份正常精液中所含圓細胞濃度應＜5×106/ml。白細胞，主要是中性粒細胞，存在于大多數(shù)人的精液中。過多的白細胞(白細胞精子癥)可能與感染和精液質量差有關，應進行微生物學檢驗以證實有無副性腺感染，但如果未發(fā)現(xiàn)白細胞也不能完全排除副性腺感染的可能性。白細胞和生精細胞可用過氧化物酶技術和全白細胞單克隆抗體法鑒別。不同類型的未成熟生精細胞在精液中出現(xiàn)常提示精子發(fā)生異常。過氧化物酶陽性的白細胞濃度不應超過1×106/ml。非精子細胞也可采用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，方法同精子計數(shù)。另外，也可以用與精子的相對濃度來表示其它類型生精細胞和白細胞的濃度。計算方法為C=S×(N/400)，C:需計算的特定類型細胞濃度(106/ml)，N:計數(shù)400個精子時同視野中的特定類型細胞數(shù)，S:樣本的精子濃度(106/ml)。

3.4 精子活力

精子的前向運動情況與受孕有密切的關聯(lián)。在第5版手冊中，將精子活動力分為前向運動(PR)、非前向運動(NP)、不活動(IM)，而不再沿用以往的將精子活動力分為a、b、c、d級的分類方法，這是新版手冊中的一個重要修訂。

可采用帶有網格的目鏡，以更好地評估精子活動力，評估過程中所檢測的區(qū)域應距離蓋玻片邊緣至少5mm以上。應在室溫或帶有加熱37℃載物臺的顯微鏡下進行精子活動力評估，由于精子活動力與環(huán)境溫度密切相關，最好將臺面溫度保持恒定在37℃。

要準確地評估精子活動力，應將精液充分混勻后，重復取樣2次分別檢測，先仔細觀察網格區(qū)計數(shù)前向運動精子，接下來是在相同的網格內的非前向運動精子，最后是不活動精子。每個樣本至少系統(tǒng)地觀察5個視野，分析的精子應＞200個。兩次分析結果之間的差異應在95%可信區(qū)間內，如果兩個樣本之間的差異過大，則應重新混勻標本后重復取樣檢查。第5版手冊將 PR≥32%、(PR+NP)≥40%作為精子活動力的參考值下限，低于此下限時受孕的機會減低。

3.5 精子存活率

精子存活率指存活精子在所檢測精子總數(shù)中的百分比。當活動精子百分數(shù)低于40%時，應檢測精子存活率。不動的精子并不都是死亡精子，如果存活但不動的精子占很大比例則提示精子鞭毛可能存在結構缺陷。推薦采用伊紅－苯胺黑染色排除法，單用伊紅染色試驗或低滲膨脹試驗進行檢測。伊紅－苯胺黑染色以及單用伊紅染色試驗的原理是，存活精子的細胞膜可阻止精子被染料伊紅所染色，而死亡精子則因細胞膜通透性改變而易被伊紅染為紅色，用光學顯微鏡或相差顯微鏡檢測可以區(qū)分活精子(未著色)和死精子(著色)，而加用苯胺黑有利于更好地觀察。而低滲腫脹試驗的基本原理則利用存活精子的細胞膜能夠形成滲透梯度的特性，當被置于低滲透壓液體中時存活精子可因細胞外水分進入細胞內而造成細胞的腫脹，死亡精子則缺乏這種現(xiàn)象，從而可以判斷精子是否存活，可用于輔助生殖技術。

3.6 精子濃度的初檢

第5版手冊中不再使用原來的“精子密度”這一名詞，而是改為“精子濃度”，以更準確地表示一定體積精液中的精子數(shù)量這一概念。在精確計數(shù)精子濃度前要進行精子濃度的初檢，以估計精確計數(shù)所需要的精液稀釋倍數(shù)。對于厚度為20μm的精液標本來說，200倍高倍鏡下每個視野下的容積約為16nl，400倍高倍鏡下每個視野下的容積約為4nl。因此，計數(shù)每個視野的精子個數(shù)，就可粗略估算精子濃度。再據(jù)此決定精液所需的稀釋倍數(shù):每400倍視野≤15個精子或200倍視野≤60個精子，采用1∶2稀釋;400倍視野16～100個精子或200倍視野64～400個精子，采用1∶5稀釋;400倍視野超過101個精子或200倍視野超過404個精子，采用1∶20稀釋。如果每個視野中的精子數(shù)目差異較大，提示標本不均勻，應重新混勻標本再取樣檢測。

當精子數(shù)目過少時，應根據(jù)檢測目的和要求的不同決定下一步的處理方式。如果不需要得到精確的精子濃度，那么當每個400倍視野中精子數(shù)目＜4個或者每個200倍視野中＜16個時，可以報告為“精子濃度＜2×106/ml”，同時應報告是否發(fā)現(xiàn)前向運動精子;如果需要獲得精確的精子濃度，可減少精液稀釋的倍數(shù)、增加檢測精液的總體積。

當任一濕片中都沒有觀察到精子時，應離心精液以確定在更大標本量中能否發(fā)現(xiàn)精子。取1ml精液用3 000g離心15min，棄去大部分上清液，將全部沉淀懸浮于約50μl精漿中，再分別取兩份10μl沉淀物仔細檢查，如果仍無法找到精子，才能做出“無精子癥”的判斷。如果在任一樣本中觀察到精子，則提示隱匿精子癥。

3.7 精子濃度和精子總數(shù)

第5版手冊特別強調每次射精中精子總數(shù)的重要性，認為精子總數(shù)能更準確地反映睪丸生精功能和輸精管道的通暢程度。精子總數(shù)是精子濃度與精液體積的乘積，因此準確測定精子濃度十分重要。推薦采用改良Neubauer血細胞計數(shù)板測定精子濃度，檢測前必須充分混勻精液標本，分別兩次取樣、兩次稀釋、兩次檢測。首先按事先估計的稀釋倍數(shù)將精液稀釋。標準稀釋液的配制方法是:將50g NaHCO3和10ml 35%(v/v)甲醛溶液加入1 000ml純水中，如果需要可添加0.25g臺酚藍或5ml飽和甲紫溶液(＞4mg/ml)加深背景顯示出精子頭部，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向計數(shù)板吹氣使其輕微濕潤，再將蓋玻片緊壓向計數(shù)池的支柱，確保蓋玻片緊貼計數(shù)池。用移液器吸取10μl剛剛稀釋好的精液，將移液器吸頭小心地接觸一個計數(shù)池V形槽的下緣，利用毛細作用使精液標本充滿計數(shù)池。計數(shù)池不應過滿或不滿，也不應移動蓋玻片。同樣將10μl標本加入到另一個計數(shù)池中。將血計數(shù)板水平放在濕盒內至少4min后開始計數(shù)。計數(shù)應使用200或400倍的相差顯微鏡，每份樣本檢測200個以上的精子以減低誤差。應計數(shù)有完整結構的精子(有頭和尾)，有缺陷的精子(大頭針狀頭或和無尾的精子頭)應分開計數(shù)并記錄。

血細胞計數(shù)板每個計數(shù)池共有9個網格，其中中央網格有5排，每排5個大方格。計數(shù)時，先評估一個計數(shù)池的中央網格，逐排計數(shù)，直到至少數(shù)到200個精子，并數(shù)完完整的一排。如果中央網格的5排中計數(shù)未滿200個精子，那么還需計數(shù)與中央網格相鄰的網格，直到數(shù)完至少200個精子。對于位于相鄰兩格分界線上的精子，只計數(shù)位于方格上界和左界的精子，而不計數(shù)位于下界和右界的精子。然后計數(shù)另一個計數(shù)池中相同體積的標本，計算兩個計數(shù)池計數(shù)結果的總數(shù)和差異。兩次計數(shù)之間的差異應在95%可信區(qū)間內，如變異過大應重新混勻標本再重復取樣計數(shù)。計算兩次計數(shù)的平均數(shù)作為最終的檢查結果。根據(jù)精液稀釋倍數(shù)計算原始精液中的精子濃度。

臨床上也可用Makler或Microcell計數(shù)池來測定精子濃度，這些計數(shù)池使用方便、不必稀釋樣本，但應與血細胞計數(shù)板的檢測結果進行比較和校正以保證其結果的可靠性。

3.8 精子形態(tài)學評估

人類精子形態(tài)的多樣性造成精子形態(tài)評估非常困難，觀察女性生殖道(尤其是性交后宮頸黏液中)的精子或從透明帶表面回收的精子有助于定義具備潛在受精能力精子的外觀。精子形態(tài)分析的關鍵是評估正常形態(tài)的精子，計算其百分比，因為只有正常形態(tài)的精子才有臨床意義。對各類畸形精子也應進行詳細分析，有特殊情況還應作記錄。

3.8.1 涂片的制備 載玻片用不掉屑的紙巾用力擦干凈備用，充分混勻標本后，根據(jù)精子濃度取5～10μl精液滴于載玻片一端，立即用另一張載玻片沿第一張載玻片表面在精液滴前方拖拉精液滴。精子濃度低時可離心濃縮標本，以獲得盡可能高的濃度(但不應超過50×106/ml)然后按照正常標本的方法涂片。過于黏稠的標本、碎片過多的標本以及用于計算機輔助評估精子形態(tài)學的標本，可取0.2～0.5ml精液加入10ml生理鹽水中稀釋，離心棄去大部分上清液，將沉淀懸浮于20～40μl液體中，再取5～10μl精子混懸液涂片。涂片行空氣干燥并固定，固定程序取決于染色方法。

3.8.2 染色方法 涂片空氣干燥后應立即固定染色，推薦采用巴氏染色法、Shorr染色法或Diff－Quik染色法。在光學顯微鏡下觀察，精子頭部頂體區(qū)呈淡藍色，頂體后區(qū)染成深藍色，中段可染為略呈紅色，尾部染成藍色或淡紅色，胞漿小滴常位于頭部下部或圍繞中段，染成粉紅色、紅色或橘色?？焖偃旧椒ㄓ捎谕科夹g會導致精子分布不均勻，無法觀察到形態(tài)學分類所需的細節(jié)，不建議使用。

3.8.3 正常精子形態(tài)學 精子包括頭、頸、中段、主段和末段。光學顯微鏡下難以觀察精子末段，因此可以認為精子由頭(頭和頸)和尾(中段和主段)組成。只有頭和尾都正常的精子才認為是正常的，所有處于臨界狀態(tài)的精子均應認為異常。精子頭外形應為光滑、輪廓規(guī)則的橢圓形，頂體區(qū)清晰，占頭部的40% ～70%，頂體區(qū)沒有大空泡，小空泡不超過2個，空泡大小不超過頭部的20%，頂體后區(qū)不含任何空泡。中段細長、規(guī)則，長度與頭部大約相等，主軸與頭部長軸在同一直線上，殘留胞漿不超過頭部大小的1/3。主段均一，比中段細，長約45μm，相當于頭部長度的10倍左右，沒有銳利的折角。

3.8.4 異常精子形態(tài)學分類 畸形精子百分率升高常與精子異常發(fā)生或附睪病變有關，畸形精子一般受精潛力較低。主要的精子缺陷類型有:①頭部缺陷:大頭、小頭、錐形頭、梨形頭、圓頭、無定形頭、有空泡的頭(未著色的空泡區(qū)域占頭部20%以上或超過2個空泡)、頂體后區(qū)存在空泡、頂體過大(＞頭部70%)或過小(＜頭部40%)、雙頭以及上述缺陷的任何組合。②頸部和中段的缺陷:中段非對稱地接在頭部、過粗或不規(guī)則、銳角彎曲、異常細的中段和上述缺陷的任何組合。③主段缺陷:短尾、多尾、斷尾、發(fā)卡形平滑彎曲、銳角彎曲、寬度不規(guī)則、卷曲或上述缺陷的任何組合。④過量殘留胞漿:胞漿的大小超過精子頭部的1/3。第5版手冊提供了一系列精子正常和異常形態(tài)的精美圖片，可供實驗人員參考。

3.8.5 精子形態(tài)學涂片的評估 染色后使用1 000倍油鏡在亮視野下觀察，應系統(tǒng)地選擇涂片上多個區(qū)域進行評估，應評估每個視野中的所有精子，每張涂片至少評估200個精子以減低誤差。兩個重復取樣的檢查結果之間的差異應在95%可信區(qū)間內，計算其平均數(shù)作為標本的正常形態(tài)百分率。檢測時僅評估具有頭部和尾部的完整精子，不計數(shù)未成熟的生殖細胞。重疊的精子和頭部枕在其他顆粒邊緣的精子也不應評估。正常形態(tài)精子的參考值下限為4%。

對所有異常形態(tài)精子進行分類，可能有助于臨床和研究工作?？勺⒚骶尤毕莸念愋筒⒂嬎悴煌毕菥拥陌俜直?。游離的精子頭部或尾部不作為精子計數(shù)，也不作為異常精子進行計數(shù)。如果所有精子都呈現(xiàn)一種特定的結構缺陷，比如小圓頭精子、無尾精子頭或大頭針狀精子，應予以正確的報告。

4 常規(guī)精液分析參考值(WHO手冊，第5版)

精液量≥1.5ml;pH值≥7.2;精子濃度≥15×106/ml;精子總數(shù)≥39×106/1次射精;精子前向運動百分率≥32%;正常形態(tài)率≥4%;精子存活率≥58%;白細胞 ＜1 ×106/ml。