韓 凌,彭 燕,孫 靜,危建安

(1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,廣州 510006;2.遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院,廣東珠海 519100)

氧化苦參堿對LoVo細胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達的影響

韓 凌1,彭 燕2,孫 靜1,危建安1

(1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,廣州 510006;2.遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院,廣東珠海 519100)

目的探討氧化苦參堿(OM)抑制人結腸癌LoVo細胞增殖和誘導凋亡的分子作用機制?方法 采用實時熒光定量PCR法以及免疫組化法檢測OM對LoVo細胞凋亡相關以及細胞骨架相關的B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)?微管蛋白1A(TUBA1A)?咬合蛋白(OCLN)的基因及蛋白表達的影響?結果OM能顯著抑制LoVo細胞增殖;可明顯抑制LoVo細胞Bcl-2的mRNA以及蛋白的表達(P0.05),抑制TUBA1AmRNA表達,同時上調(diào)OCLN蛋白的表達,但并不能明顯上調(diào)OCLN mRNA的表達?結論OM抑制LoVo細胞增殖,可能與下調(diào)LoVo細胞Bcl-2?TUBA1A表達以及上調(diào)OCLN表達有關?

腫瘤細胞,培養(yǎng)的;細胞凋亡;細胞骨架;氧化苦參堿

氧化苦參堿(oxymatrine,OM)是豆科槐屬植物苦參(SophoraflavescensAit.)?苦豆子(S.AlopecuroidesL.)?廣豆根(S.SubprostrataChun)等中草藥的有效活性成分?體外和體內(nèi)實驗研究已表明,OM對多種腫瘤細胞均具有抑制細胞增殖?誘導細胞凋亡的作用[1-3]?以OM為主要成分的注射液具有明確的抗腫瘤作用,已廣泛的應用于臨床,但確切的分子機制并不明確?因OM可導致細胞形態(tài)及數(shù)量發(fā)生變化,作者推測OM的作用機制可能與影響腫瘤細胞凋亡及細胞骨架相關基因及蛋白表達有關?本研究選擇人結腸癌LoVo細胞為研究對象,采用熒光定量PCR以及免疫組化法觀察OM對LoVo細胞B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)?微管蛋白1A(tubulin alpha 1A,TUBA1A)?咬合蛋白(occludin,OCLN)等基因表達的影響,為OM在臨床治療上的應用提供實驗依據(jù)?

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 LoVo細胞為武漢中國生物品典藏中心保存,氧化苦參堿購于陜西一星生物制劑公司,胎牛血清購于美國Invitrogen公司,OCLN抗體購于Abcom公司,Bcl-2抗體?免疫組化試劑盒購于北京中衫金橋公司,MEM培養(yǎng)液?PBS?0.25%胰蛋白酶購于美國Invitrogen公司,TRIzol購于Invitrogen公司,PrimeScriptTM RT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM試劑購于大連Takara公司,熒光定量PCR儀購于ABI公司,高速冷凍離心機購于Beckman公司,CO2培養(yǎng)箱購于Thermo公司,倒置顯微鏡購于日本NIKON公司,超凈工作臺購于新加坡ESCO公司?

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物配制 人結腸癌LoVo細胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素),于37℃?飽和濕度?5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞消化采用0.25%含EDTA胰蛋白酶?OM采用無血清MEM配制成濃度為20mg/mL儲存液,0.22μm一次性濾器過濾?-20℃避光保存?zhèn)溆?使用時配成終濃度為2mg/mL?

1.2.2 實驗分組 實時熒光定量PCR實驗分3組,分別是:空白對照組(不加任何藥物)?高劑量 OM 組(2mg/mL)及TNF-α組(100ng/mL);免疫組化檢測分為3組,分別是:空白對照組(不加任何藥物)?高劑量OM組(2mg/mL)及低劑量OM組(1mg/mL)?各組均在細胞培養(yǎng)24h后加藥,加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h或48h,進行實驗?

1.2.3 mRNA表達檢測 每組設3個復孔,加藥培養(yǎng)24h后,棄去培養(yǎng)液,用預冷的PBS洗滌1次,棄去PBS后加入1mL TRIzol并收集細胞,按說明書操作提取總RNA,用紫外分光光度計測定260nm及280nm處吸光度值(A260?A280),計算RNA樣品的純度和濃度?按操作說明書合成cDNA?按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑說明進行實時熒光定量PCR反應,反應體系20μL,擴增條件:95℃30s預變性,95℃變性5s,60℃退火34s,40個循環(huán),每份樣品做復孔?mRNA相對表達量用比較Ct值法計算,以看家基因GAPDH為內(nèi)參,用看家基因和靶基因Ct值差(ΔCt)計算靶基因相對看家基因GAPDH 表達量[1/(2ΔCt)],與空白對照組比較,計算其他各組mRNA的相對表達量(Ratio)?引物應用Invitrogen公司在線軟件Oligo PerfectTMDesigner設計,用BLAST進行比對,由Invitrogen公司合成,實驗用引物相關情況見表1?

表1 實驗所用引物

1.2.4 免疫組化檢測 按試劑盒說明書進行?4%多聚甲醛固定細胞后自然吹干,加1～2滴3%H2O2去離子水孵育10min,PBS洗3次,每次2min;將玻片吹干,每張玻片上滴加100μL×1/100Bcl-2,4℃冰箱孵育過夜;第2天取出,PBS洗3次,每次2min,加PV-6000 37℃孵育30min,PBS洗3次,每次2min;加DAB顯色,流水清洗,晾干;中性樹膠固定;顯微鏡觀察拍照?顯色為棕色顆粒時表示特異蛋白陽性表達?

1.3 統(tǒng)計學處理 特異基因mRNA表達結果采用t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義?

2 結 果

2.1 相關基因的特異性引物溶解曲線及擴增曲線 基因擴增后,Bcl-2?OCLN?TUBA1A和 GAPDH 基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線?擴增曲線見圖1?2?各基因擴增曲線均呈明顯的S型曲線,擴增產(chǎn)物的熔解曲線均為特異高尖的信號峰,說明擴增產(chǎn)物單一,無非特異性擴增片段?

圖1 各基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線

圖2 各基因擴增產(chǎn)物的擴增曲線

2.2 OM 對 LoVo細胞 Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA 表達的影響 加藥培養(yǎng)24h后,高劑量OM 組Bcl-2?TUBA1A mRNA明顯下調(diào),與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);OCLN有上調(diào)趨勢,但與空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)?TNF-α組 Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達的作用趨勢與高劑量OM組一致,但與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)?見表2?

表2 OM 對LoVo細胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達的影響(±s,n=3)

表2 OM 對LoVo細胞Bcl-2?OCLN?TUBA1AmRNA表達的影響(±s,n=3)

*:P0.05,與空白對照組相比?

組別Bcl-2 OCLN TUBA1A空白對照組1.285±0.224 1.93±0.722 1.135±0.116高劑量 OM 組 0.799±0.139* 2.666±0.869 0.616±0.022*TNF-α組1.002±0.054 2.788±0.515 0.998±0.104

2.3 OM對Bcl-2蛋白表達的影響 Bcl-2主要表達于LoVo細胞的細胞質,空白對照組細胞數(shù)量較多,胞質內(nèi)可見明顯棕色染色;加藥培養(yǎng)24h后,低劑量OM組LoVo細胞數(shù)量明顯減少,與空白對照組比較,胞質內(nèi)僅見淺黃棕色染色;高劑量OM組僅見少量LoVo細胞留存,棕色顆粒表達明顯下調(diào)?研究結果表明OM可明顯下調(diào)LoVo細胞Bcl-2蛋白的表達?見封2圖3?

2.4 OM對OCLN蛋白表達的影響 選取高?低劑量OM,分別作用LoVo細胞24?48h,觀察OM對OCLN蛋白表達的影響,結果見封2圖4及插Ⅰ圖5?OCLN主要表達于LoVo細胞膜上及胞質內(nèi)?空白對照組LoVo細胞OCLN表達較少?加藥培養(yǎng)24h后,低劑量OM組可見OCLN表達明顯增多,細胞內(nèi)棕色顆粒明顯增多,染色加深;隨著OM劑量的加大,細胞染色也逐漸加深?加藥培養(yǎng)48h后,高?低劑量OM組細胞數(shù)量相對于空白對照組明顯減少,而細胞膜和細胞質內(nèi)棕色顆粒隨劑量增加而逐漸增加?研究表明,OM可明顯上調(diào)LoVo細胞OCLN蛋白的表達?

3 討 論

3.1 OM對LoVo細胞Bcl-2基因及蛋白表達的影響 人的Bcl-2基因是從大多數(shù)濾泡型非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤中分離獲得的?1988報道Bcl-2基因可使細胞存活時間延長?1990年進一步確證Bcl-2基因具有抗細胞凋亡的功能后,Bcl-2基因作為重要的凋亡抑制基因,在多種腫瘤中得到證實?近年來的研究表明,Bcl-2基因的異常表達,與肺癌的發(fā)生?發(fā)展?預后以及腫瘤耐藥密切相關[4]?徐康等[5]發(fā)現(xiàn)羥喜樹堿可誘導結腸癌LoVo細胞凋亡,同時下調(diào)Bcl-2基因的表達,從而起到抗結腸癌細胞的作用?本研究表明,OM可下調(diào)Bcl-2基因表達;同時用免疫組化方法進一步證實OM可下調(diào)Bcl-2蛋白表達,提示OM誘導LoVo細胞凋亡與影響B(tài)cl-2基因與蛋白表達有關?

3.2 OM對結腸癌LoVo細胞TUBA1A基因及蛋白表達的影響 腫瘤細胞的運動能力是浸潤和轉移的先決條件?細胞骨架被認為是生長因子參與和作用的多種細胞反應的最初靶結構?作為細胞骨架主要成分之一的微管,在細胞形態(tài)的維持?細胞運動以及在細胞分裂過程中發(fā)揮重要作用?目前在真核生物中已經(jīng)確定的微管蛋白有7種,其中a-tubulin和β-tubulin是微管結構的主要組成,在真核生物細胞中普遍存在,并且高度保守性[6]?研究表明,tubulin表達在非小細胞肺癌(NSCLC)中增高可能表示預后不良,而且微管蛋白是紫杉醇作用的位點,與紫杉醇的獲得性耐藥也密切相關?tubulin的表達與紫杉醇化療敏感性相關,tubulin表達降低則對紫杉醇敏感性增加[7-8]?本實驗發(fā)現(xiàn)OM可明顯下調(diào)TUBA1AmRNA表達,推測OM可能通過影響TUBA1A表達而影響LoVo細胞的形態(tài)以及運動能力?而OM能否提高LoVo細胞對紫杉醇的敏感性仍需進一步研究?

3.3 OM對結腸癌LoVo細胞OCLN基因及蛋白表達的影響 腫瘤細胞從原發(fā)部位解離是腫瘤侵襲?轉移過程的第1個及重要環(huán)節(jié)?而明確細胞解離機制則有利于闡明腫瘤侵襲轉移的機制,并探索限制癌癥侵襲轉移的治療新方法?緊密連接是細胞間連接處的復雜結構,在細胞間黏著等生理學功能方面起重要作用?緊密連接與細胞癌變有關,在上皮衍生癌中經(jīng)常可發(fā)現(xiàn)緊密連接結構缺失?電子顯微鏡證實,緊密連接在細胞癌變中逐漸減少?OCLN是被克隆的緊密連接的第1個轉膜蛋白,其不僅是緊密連接的結構成分,同時也是功能成分?OCLN作為緊密連接的重要轉膜蛋白可能在細胞解離過程中起重要作用[9]?OCLN在胃腸分化腺癌中的表達水平與正常上皮細胞一致,但在低分化腺癌中表達水平顯著降低[10]?朱光能等[11]運用免疫組化技術檢測OCLN在人肝細胞癌中的表達,并分析OCLN表達與肝癌發(fā)生?發(fā)展的關系?結果表明OCLN主要定位于肝細胞膜,肝細胞癌與癌旁肝組織相比,OCLN表達陽性率及其強度均明顯下降,其改變在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用?本研究發(fā)現(xiàn)OM可上調(diào)OCLN基因表達,采用免疫組化方法進一步證實OM可上調(diào)OCLN蛋白表達,本研究結果提示,OM可能通過影響OCLN的基因與蛋白的表達,從而恢復腫瘤細胞中被破壞的緊密連接,影響腫瘤細胞的遷移,而起到抗腫瘤的作用?

綜上所述,OM抑制LoVo細胞增殖的作用,可能與下調(diào)細胞Bcl-2基因和蛋白表達有關?另外,OM也可能通過下調(diào)TUBA1A,上調(diào)OCLN基因表達,從而影響LoVo細胞的形態(tài)?細胞周期以及運動與遷移的能力,而發(fā)揮抗癌的作用?

[1] 張于人,朱金水,王小銀,等.氧化苦參堿注射液聯(lián)合小劑量紫杉醇對人胃癌SGC-7901細胞血管內(nèi)皮生長因子及CXC趨化因子受體4表達的影響[J].中西醫(yī)結合學報,2010,8(11):1029-1035.

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Effects of oxymatrine on expressions of Bcl-2,OCLN and TUBA1A in human colon carcinoma LoVo cells

,,,
(1.,,510006,;2.,,519100,)

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of oxymatrine(OM)on inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human colon carcinoma LoVo cells.MethodsUsing fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry assay to detect the effects of OM on apoptosis and cytoskeleton-related molecular gene and protein expression,such as Bcl-2,OCLN,TUBA1Aon LoVo cells.ResultsOM could inhibit LoVo cells proliferation and significantly inhibit Bcl-2gene and protein expression on LoVo cells.OM could also significantly inhibit TUBA1Agene expression on LoVo cells.OM showed only a slight increase trend on OCLN gene expression,but with immunohistochemical assay OM could significantly increase the OCLN protein expression on LoVo cells.ConclusionThe molecular mechanism of OM to inhibit tumor cell proliferation may be related to down-regulate Bcl-2and TUBA1Aexpression while increased expression of OCLN on LoVo cells.

tumor cells,cultured;apoptosis;cytoskeleton;oxymatrine

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.007

A

1671-8348(2012)18-1805-03

2011-10-09

2012-03-06)

?臨床研究?