葛蓓蕾,徐 霞,陳小讓

(鄭州大學(xué):1.實驗動物中心;2.藥學(xué)院,鄭州 450052)

新型八核銅配合物乳劑的體內(nèi)外抗腫瘤作用*

葛蓓蕾1,徐 霞2,陳小讓2

(鄭州大學(xué):1.實驗動物中心;2.藥學(xué)院,鄭州 450052)

目的探討新型八核銅配合物乳劑(N-Cu)的體內(nèi)?外抗腫瘤作用?方法 采用甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測不同濃度N-Cu對HT29?HeLa?SGC7901和EC9706腫瘤細(xì)胞增殖的影響?利用S180腹水瘤小鼠模型觀察不同濃度N-Cu的體內(nèi)抗腫瘤作用?采用流式細(xì)胞儀測定不同濃度N-Cu對S180細(xì)胞周期的影響?結(jié)果N-Cu作用4種腫瘤細(xì)胞24h后,細(xì)胞增殖均受到了不同程度的抑制,且呈濃度依賴性?N-Cu對荷S180小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用?N-Cu能使G0/G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞減少,細(xì)胞被阻滯于G0/G1期,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?結(jié)論N-Cu在體內(nèi)?外具有抗腫瘤作用?

抗腫瘤藥;細(xì)胞周期;腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的;小鼠;八核銅配合物

惡性腫瘤是危害人類健康的嚴(yán)重疾病之一?隨著對腫瘤形成機(jī)制研究的深入,化療在腫瘤的治療中日益重要?由于傳統(tǒng)的抗腫瘤藥價格昂貴,且對機(jī)體均有明顯的毒副作用[1],因此,研究開發(fā)廉價?低毒的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前面臨的迫切問題?本實驗所用的新型八核銅配合物乳劑(new eight-copper complex emulsion,N-Cu)是由鄭州大學(xué)化學(xué)系無機(jī)教研室合成的新型銅配合物的納米材料,具有特殊的雙螺旋結(jié)構(gòu)?它是以抗高血壓藥替米沙坦為配體,和8個銅離子配合在一起的相對分子質(zhì)量為8 723的大分子化合物?它在甲醇?乙醇中的溶解 度 很 小,在 二 甲 基 甲 酰 胺 (N,N-dimethylformamide,DMF)?二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)?乙腈?二氯甲烷中溶解度較大?用一定比例的DMSO促溶后,溶解在0.1mmol/L Tris-HCl中 比 較 穩(wěn) 定,該 溶 液 在 238nm 和296nm處有較大的吸收度,可以用紫外分光光度法定量?

本組在進(jìn)行了急性毒性研究的基礎(chǔ)上,對N-Cu的體內(nèi)外抗腫瘤作用進(jìn)行了研究,目的在于探討將其開發(fā)成為廉價?低毒的抗腫瘤藥物的可能性?

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試品與試劑 N-Cu為化學(xué)合成物,相對分子質(zhì)量為8 723,由鄭州大學(xué)化學(xué)系無機(jī)教研室合成提供;順鉑(5mg/mL)注射液(DDP),云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司提供,批號:20081203;細(xì)胞周期檢測試劑盒為南京凱基生物科技有限公司產(chǎn)品,批號:KGA511?

1.1.2 實驗細(xì)胞株及動物 本實驗所用細(xì)胞株分別為人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29?人宮頸癌細(xì)胞HeLa?人胃癌細(xì)胞SGC7901和人食管癌細(xì)胞EC9706,均為貼壁生長的細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,在鄭州大學(xué)藥學(xué)院長期傳代培養(yǎng)?小鼠S180腹水瘤細(xì)胞,引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,在鄭州大學(xué)實驗動物中心傳代保存?無特定病原體級昆明種小鼠90只,體質(zhì)量(20.0±2.0)g,雌性,由河南省實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)合格證號:SCXK(豫)2005-0001?普通環(huán)境條件下進(jìn)行該實驗,溫度20～22℃,相對濕度45%～50%,自由進(jìn)食和飲水[2]?

1.1.3 實驗儀器 電子天平,德國賽多利斯有限公司,BP211D型;離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠,TDL80-2B型;倒置顯微鏡,日本Olympus公司,BH-2型;CO2培養(yǎng)箱,德國 Hereaus公司生產(chǎn),W1-TS606/2-I型;醫(yī)用凈化工作臺,蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司,CJ-2F型;酶標(biāo)儀,DYNEX技術(shù)有限公司,ISPA-0045型;流式細(xì)胞儀,美國Coulter公司,EPICXU型?為100.00?50.00?25.00?10.00?5.00μg/mL;實驗陽性對照組用順鉑濃度為5.00μg/mL,陰性對照選用空白乳劑,

1.2 實驗方法

1.2.1 甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法測定N-Cu對腫瘤細(xì)胞增殖的影響[3-6]取對數(shù)生長期的HT29?HeLa?SGC7901?EC9706細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔200μL;待細(xì)胞貼壁后,實驗組加不同濃度N-Cu溶液200μL/孔,使終濃度分別空白對照用DMSO,每組?設(shè)6個平行復(fù)孔?置5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24h后,每孔加入20μL濃度為5mg/mL的 MTT;繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄全部上清液,每孔加DMSO 200μL,37℃震蕩孵育10min;用酶標(biāo)儀檢測490nm處的吸光度(absorbance,A)值?抑制率計算公式:抑制率(%)=(對照組A490-加藥組A490)∕對照組A490×100%?采用半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration 50,IC50)計算軟件計算IC50,以上實驗重復(fù)3次?

表1 N-Cu對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率(±s,%,n=3,24h)

表1 N-Cu對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率(±s,%,n=3,24h)

抑制率DDP 5.00(陽性對照)藥物濃度(μg/mL) HT29抑制率 HeLa抑制率 SGC7901抑制率 EC9706 10.70±2.41 3.88±0.37 4.42±0.09 15.44±1.47 N-Cu 5.00 5.26±1.77 6.52±1.18 5.68±3.11 10.20±1.06 10.00 21.43±0.42 9.45±0.58 10.46±2.04 23.50±0.99 25.00 48.07±2.31 56.29±0.06 22.29±0.71 37.82±2.22 50.00 78.50±4.00 86.57±1.89 66.57±1.45 59.68±0.55 100.00 86.80±0.84 91.01±3.01 77.13±0.21 74.03±4.86

1.2.2 N-Cu對荷S180腹水瘤小鼠的體內(nèi)抑瘤實驗 選擇接種S180腹水瘤后6～8d的健康小鼠,無菌條件下抽吸腹水,用生理鹽水1∶3稀釋后,倒置顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞,調(diào)整其濃度至1×107個/mL[7],用75%乙醇消毒小鼠腹腔外表面,以0.5mL/只(含腹水瘤細(xì)胞5×106個)[8]接種到腹腔?接種次日,稱量每只小鼠的體質(zhì)量后,隨機(jī)分成生理鹽水陰性對照組?溶劑對照組?順鉑陽性對照組及 N-Cu高(0.80mg/mL)?中(0.40mg/mL)?低(0.20mg/mL)濃度組?每組15只?S180腹水瘤模型建立24h后,尾靜脈注射不同濃度N-Cu 0.2mL/10g治療,每日1次,連續(xù)給藥7d?用藥期間每隔一天稱量小鼠的體質(zhì)量并記錄?第7天給藥后24h,每組隨機(jī)挑取5只小鼠,抽取全部腹水,測量腹水體積?停藥次日將每組剩余的10只小鼠正常飼養(yǎng),每日觀察小鼠的狀況并記錄死亡時間,計算存活天數(shù)(存活超過30d的按30d計算)及生命延長率[9]?

生命延長率(%)=(治療組平均存活天數(shù)/對照組平均存活天數(shù)-1)×100%?

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測N-Cu對S180細(xì)胞周期的影響 第7天給藥后24h,每組隨機(jī)抽取5只動物的瘤液,混合后留取1 mL?取留取的腹水細(xì)胞置入培養(yǎng)液(含10%胎牛血清?青霉素100μg/mL及鏈霉素100μg/mL)中37℃培養(yǎng)?等到細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗并加入0.25%的胰酶適量消化[10],吹打使團(tuán)塊細(xì)胞分離,細(xì)胞分布均勻,制成單細(xì)胞懸液?置入離心管離心后待測定?

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以±s表示?組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析?檢驗水準(zhǔn)α=0.05?

2 結(jié) 果

2.1 N-Cu體外實驗 N-Cu分別作用于4種腫瘤細(xì)胞24h后,細(xì)胞增殖均受到了不同程度的抑制?且在藥物濃度為100.00μg/mL時,抑制率都達(dá)到了70%以上,其中,對 HeLa細(xì)胞的抑制作用最明顯,高達(dá)91.01%?在5～100μg/mL實驗濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性,作用時間在24h內(nèi)抑制率上升?見表1?N-Cu對4種腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值均小于35.00μg/mL,其中對HeLa細(xì)胞作用的IC50最小,對SGC7901細(xì)胞作用的IC50最大?見表2?

2.2 N-Cu體內(nèi)實驗 體內(nèi)實驗結(jié)果表明,N-Cu各劑量組小鼠平均體質(zhì)量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;N-Cu各劑量組腹水體積與生理鹽水組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),各用藥組與生理鹽水組相比,生命延長率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?結(jié)果見表3～5?

表2 N-Cu對不同腫瘤細(xì)胞增殖的IC50(±s,μg/mL,n=3,24h)

表2 N-Cu對不同腫瘤細(xì)胞增殖的IC50(±s,μg/mL,n=3,24h)

腫瘤細(xì)胞 IC50(μg/mL)HT29 23.50±0.32 HeLa 17.50±0.02 SGC7901 34.50±1.04 EC9706 31.95±0.51

表3 N-Cu對荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響(n=15,±s)

表3 N-Cu對荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響(n=15,±s)

組別 濃度(mg/mL)動物體質(zhì)量(g)1d 3d 5d 7d生理鹽水組 0.90 19.78±0.41 20.45±1.11 22.06±1.26 21.28±0.85乳劑對照組 0.50 19.66±0.81 21.90±0.74 22.18±1.11 23.91±1.34順鉑組 0.02 20.02±1.22 19.63±0.75 20.20±2.01 19.66±1.84低劑量組 0.20 20.32±0.47 21.18±0.62 21.71±1.30 23.30±0.91中劑量組 0.40 20.12±0.59 20.69±0.96 22.85±1.27 23.92±1.46高劑量組 0.80 20.02±0.59 21.08±1.14 23.78±1.16 24.88±1.77

表4 N-Cu對荷瘤小鼠腹水量的影響(n=5,±s)

表4 N-Cu對荷瘤小鼠腹水量的影響(n=5,±s)

與生理鹽水組相比,*:P0.05?

組別 濃度(mg/mL) 平均腹水量(mL)生理鹽水組0.90 3.15±1.12乳劑對照組 0.50 2.94±0.95順鉑組 0.02 1.76±0.47低劑量組 0.20 2.28±0.16*中劑量組 0.40 2.03±0.82*高劑量組 0.80 1.43±0.55*

表5 N-Cu對荷瘤小鼠生命延長率的影響(n=10,±s)

表5 N-Cu對荷瘤小鼠生命延長率的影響(n=10,±s)

注:與生理鹽水組相比,*P0.05?

組別 平均存活日期(d) 生命延長率(%)生理鹽水組14.2±3.2乳劑對照組 15.4±4.1 8.5±1.78順鉑對照組 21.6±2.9 52.1±0.45低劑量組 16.9±3.6 19.0±1.30*中劑量組 19.2±4.4 35.2±1.85*高劑量組 21.2±3.7 49.3±1.60*

2.3 流式細(xì)胞儀檢測N-Cu對S180細(xì)胞周期的影響 N-Cu能明顯抑制S180細(xì)胞周期的變化,使G0/G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞減少,但對S180細(xì)胞增殖周期G2/M期細(xì)胞作用不明顯,其中,高劑量組作用最明顯,G0/G1期細(xì)胞達(dá)到76.1%,中劑量組達(dá)到72.3%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?結(jié)果見表6和圖1?

表6 N-Cu對S180細(xì)胞周期的影響(±s,%,n=3)

表6 N-Cu對S180細(xì)胞周期的影響(±s,%,n=3)

*:P0.05,與生理鹽水組相比?

組別 G0/G1期 S期 G2/M期生理鹽水組48.7±1.6 38.7±0.7 12.5±0.9乳劑對照組 48.6±1.2 35.9±0.5 15.5±0.3低劑量組 50.1±1.8 37.6±0.6 12.3±1.0中劑量組 72.3±1.1* 13.6±1.5* 14.1±0.8高劑量組 76.1±0.9* 12.7±1.2*11.2±0.8

圖1 N-Cu作用S180 24h后的流式細(xì)胞周期圖

3 討 論

隨著組織培養(yǎng)方法的發(fā)展,采用體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞進(jìn)行抗癌新藥的篩選已成為重要的手段?目前抗腫瘤藥物體外篩選的常用實驗方法主要有MTT比色分析法?硫化羅丹明法(sulforhodamine B,SRB)法?3H-TdR 摻入法?CCK-8法等[11],其中,MTT比色法快速簡便?應(yīng)用廣泛,是目前各實驗室最常用的體外篩選方法?本實驗 MTT結(jié)果表明,N-Cu在體外對4種腫瘤細(xì)胞的增殖都有抑制作用,且在5～100μg/mL實驗濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性關(guān)系,尤其對HeLa細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),增殖抑制率高達(dá)91.01%,其IC50值最小;對SGC7901細(xì)胞作用的IC50最大,即4種細(xì)胞中,對HeLa細(xì)胞最為敏感?

動物移植性腫瘤具有成活率高,且可以同時提供大量的腫瘤模型的特點(diǎn),應(yīng)用也比較廣泛?本組動物實驗結(jié)果表明,NCu對荷瘤小鼠自身的生長無明顯的抑制作用,對腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用,與對照組相比,中高劑量組的平均腹水量顯著降低,生命延長率明顯提高,分別為35.2%和49.3%,說明N-Cu能顯著抑制腹水型S180細(xì)胞的增殖?

細(xì)胞周期(cell cycle)是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個過程[12]?無論是正常組織細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞,其增殖均與細(xì)胞周期密切相關(guān)?細(xì)胞周期中的G0/G1期和G2/M期在DNA損壞因素的作用下可發(fā)生阻滯?腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞周期運(yùn)行失控和不分化,細(xì)胞群體主要處于DNA合成活躍的S期;而分化的細(xì)胞群體則主要處于DNA合成靜止的G0/G1期[13]?因此,抑制細(xì)胞周期的G0/G1期的RNA及核蛋白體的合成,可間接地使腫瘤細(xì)胞的RNA合成減少[14]?本實驗細(xì)胞周期結(jié)果表明,N-Cu能明顯抑制S180細(xì)胞周期的變化,使G0/G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞減少?其中,高劑量組作用最明顯,G0/G1期細(xì)胞達(dá)到76.1%,中劑量組達(dá)到72.3%?

本研究結(jié)果表明,N-Cu在體內(nèi)?外具有明顯的抗腫瘤活性,其作用機(jī)制及活性成分有待進(jìn)一步研究?

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Study on anti-tumor effect of a new eight-copper complex emulsion in vitro and in vivo*

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(:1.;2.,,450052,)

ObjectiveTo study the anti-tumor effect of a new eight-copper complex emulsion(N-Cu)invitroandinvivo.MethodsThe effect of N-Cu on proliferation of HT29,Hela,SGC7901andEC9706cancer cell lines were evaluated by MTT reduction assay.The in vivo anti-tumor effect was examined in tumor-bearing mice.Cell cycle was determined by flow cytometry.ResultsNCu significantly inhibited the proliferation of the four tumor cell lines after 24h.With increasing drug concentration,the inhibition was significantly enhanced.TheResultsin vivo showed that N-Cu had better anti-tumor effects.N-Cu by flow cytometry showed that N-Cu with anti-S180cell proliferation,an increase in G0/G1phase and decrease in S phase.Cells were arrested in G0/G1phase.The difference was statistically significant(P0.05).ConclusionN-Cu possesses the anti-tumor effectinvivoandinvitro.

antineoplastic agents;cell cycle;tumor cells,cultured;mice;nanoporous octanuclear Cu(Ⅱ)

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.003

A

1671-8348(2012)16-1567-03

* 基金項目:河南省高?？萍紕?chuàng)新人才項目(2010HASTIT016)?

2011-10-11

2011-12-23)

?綜 述?