于曉春 羅時(shí)敏 黃昭 楊智 程園園 劉繼云

SOCS1調(diào)控未成熟樹突細(xì)胞分化誘導(dǎo)肝移植免疫耐受及機(jī)制研究

于曉春 羅時(shí)敏 黃昭 楊智 程園園 劉繼云

目的 探討細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子-1（Suppressors of cytokine signaling-1,SOCS1）基因腺病毒轉(zhuǎn)染未成熟的樹突細(xì)胞（Dendritic cells，DC），并免疫受體小鼠，通過小鼠肝移植模型，觀察免疫耐受的效果并探討可能的機(jī)制。方法 構(gòu)建SOCS1腺病毒并PCR鑒定，感染體外分離、培養(yǎng)的小鼠骨髓樹突細(xì)胞，Westernblot法檢測SOCS1表達(dá)。以未轉(zhuǎn)染組及空白轉(zhuǎn)染組為對照，免疫肝移植小鼠模型，檢測受體小鼠脾臟淋巴細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR），檢測血清IL-2和IFN-γ水平及肝臟組織IL-2和IFN-γmRNA表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建并鑒定轉(zhuǎn)染腺病毒，感染DC后，SOCS1蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組及空白轉(zhuǎn)染組顯著增高（P＜0.05）。SOCS1基因修飾的DC免疫肝移植模型小鼠后，受體小鼠脾臟淋巴細(xì)胞MLR較未轉(zhuǎn)染組及空白對照免疫受體組小鼠顯著下降（P＜0.05）；SOCS1-DC免疫受體小鼠血清IL-2和IFN-γ水平及肝臟mRNA表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論 通過腺病毒轉(zhuǎn)染使SOCS1在DC中過度表達(dá)，用以體內(nèi)免疫同種異體肝移植受體小鼠，能有效減輕同種移植排斥反應(yīng)，并在一定程度上誘導(dǎo)形成免疫耐受。

細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子-1；樹突狀細(xì)胞；肝移植；移植物排斥

器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)是影響移植物功能及收者生存質(zhì)量的重要因素之一[1]。近年來，多種新型免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，雖然降低了器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)生率，但過度抑制了機(jī)體免疫[2]。因此，有效的抑制同種移植排斥反應(yīng)，并保持機(jī)體正常的免疫力是解決移植排斥的有效辦法。近年研究發(fā)現(xiàn)，髓系未成熟樹突狀細(xì)胞亞群(immature DC subset，imDC)由于表面粘附輔助分子如B7、CD40等缺乏，則具有免疫耐受性，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞失能、低反應(yīng)型以及Th2細(xì)胞極化，并且誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，對于器官移植的免疫穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的作用[3]。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子（Suppressor of cytokine signaling-1，SOCS1）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與細(xì)胞因子JAK-STAT信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，能夠抑制白介素、IFN等多種因子的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[4-5]。本實(shí)驗(yàn)采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)DC內(nèi)的SOCS1的表達(dá)，并免疫受體小鼠，通過小鼠肝移植模型，觀察免疫耐受的效果并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞系 供體C57BL/6小鼠、受體BALB/C小鼠，6～8周，體重20～22g（上海必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司），293細(xì)胞株購（上海中科院細(xì)胞研究所）。

1.2 主要試劑 RPMJ-1640和胎牛血清（Gbico公司，美國），LPS（Sigma-Aldrich公司，美國），引物（上海生工生物技術(shù)公司）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO公司，日本）；SOCS1、β-actin蛋白印跡試劑盒（Cell Signal公司，美國），小鼠白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素12(IL-12)、ELISA檢測試劑盒（Biotec公司，美國）。

1.3 腺病毒載體 編碼SOCS1基因的復(fù)制缺欠病毒載體（Ad-SOCS1）及空白對照腺病毒Ad-GFP病毒（北京本元正陽基因技術(shù)有限公司）。

1.4 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測定 用已獲得的重組病毒大量感染293細(xì)胞，當(dāng)293細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)開始脫落時(shí)，收獲病變細(xì)胞及培養(yǎng)液，3000r／m、5min離心兩次棄上清，并在-70℃和37℃反復(fù)凍融3次，每次30min，4℃ 3000r／m離心5min，收集上清。按試劑盒說明純化病毒。OD260法測定病毒顆粒滴度（VP/mL），TCID50法測定病毒感染滴度（IU/mL）。

1.5 重組腺病毒感染小鼠DC 頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌切取脛骨、股骨，PBS沖出骨髓細(xì)胞，Tris-NH4Cl低滲裂解紅細(xì)胞后，用含10% FBs的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入rmGM-CSF(10ng/mL)，接種于24孔培養(yǎng)板，去除懸浮的粒細(xì)胞，第5d收集半貼壁細(xì)胞(DC)用復(fù)合感染指數(shù)(MOI)為1:100的重組病毒Ad-SOCS1及Ad-GFP感染DC，未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的骨髓DC作為對照。感染后18h，吸盡含病毒的培養(yǎng)液，更換含rmGM-CSF的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，6h后收獲細(xì)胞。以上三組細(xì)胞分別稱為DC-SOCS1、DC-GFP及imDC，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 Western Blotting檢測Ad-SOCS1對DC的轉(zhuǎn)染效果 各組細(xì)胞1×107/mL，收集細(xì)胞蛋白，并測定樣品蛋白含量。等量蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉4℃過夜，加一抗室溫?fù)u晃2h，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:5000，Sigma)室溫?fù)u晃1h，以上各步驟間用TBS (tween-tris-bufered saline solution)洗10min×3次。暗室內(nèi)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯色，X線底片曝光、顯影、定影，底片用凝膠圖像分析儀CheniImager5500 V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件進(jìn)行定量分析得到光密度值(Optical density，OD)。

1.7 小鼠分組及處理 (1)受體小鼠分成4組，每組8只。移植前7d，3組小鼠分別經(jīng)靜脈注入2×106個供體來源imDC、DCGFP及DC-SOCS1，等量PBS注入的受體小鼠作為空白對照。4組小鼠接受原位肝移植；(2)原位肝移植：采用雙袖套法，供體異氟醚麻醉，上腹部全橫切口進(jìn)腹，切除膽囊，完全游離門靜脈至腸系膜上靜脈水平，停止異氟醚麻醉，IVC注入生理鹽水，斷肝動脈，取出游離肝臟，放入4℃ UW培養(yǎng)液中。受體手術(shù)切除肝臟采用類似方法，植入供肝，各血管袖套吻合，膽管內(nèi)置供體膽管支撐管。第14d處死動物并檢測免疫學(xué)指標(biāo)。

1.8 血清IL-2和IFN-γ的檢測 肝移植術(shù)前及術(shù)后第14d，取受體外周血，應(yīng)用ELISA法檢測IL-2和IFN-γ的水平。

1.9 受者脾臟細(xì)胞同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）檢測移植14d收獲脾臟，制備淋巴細(xì)胞懸液，2.5:1、5:1、10:1、20:1的比例與γ射線面或C57BL/6脾淋巴細(xì)胞混合，培養(yǎng)3d。液閃計(jì)數(shù)儀檢測[3H]-TdR。

1.10 移植肝臟內(nèi)IL-2和IFN-γmRNA表達(dá)的測定 提取肝組織的mRNA，按試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，用凝膠成像系統(tǒng)照相，以Bio-Image Analysis System進(jìn)行半定量分析，計(jì)算目的條帶吸光度(A)值與內(nèi)參區(qū)帶A值的比值，作為目的mRNA的相對含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用χ2分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的滴度 病毒顆粒滴度為1.7×1011VP/mL，病毒感染滴度為1.9×109IU/mL。

2.2 SOCS1基因轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞后SOCS1蛋白的表達(dá) Ad-SOCS1轉(zhuǎn)染后的DC細(xì)胞較Ad-GFP轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組的SOCS1蛋白表達(dá)顯著增高，從而表明Ad-SOCS1轉(zhuǎn)染有效，明顯上調(diào)了轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞內(nèi)SOCS1基因的表達(dá)，如圖1。

2.3 各受者小鼠脾臟MLR采用MLR方法檢測各組小鼠免疫系統(tǒng)的影響 imDC和DC-GFP組小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞對供者抗原刺激反應(yīng)無明顯區(qū)別，與空白組比較有一定程度下降，但這種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.051），而DC-SOCS1組與imDC和DCGFP組小鼠比較，脾臟淋巴細(xì)胞對供者抗原刺激反應(yīng)則進(jìn)一步降低（P＜0.05），與空白組比較更有顯著下降（P＜0.01），如圖2。

2.4 肝移植術(shù)前及術(shù)后血清IL-2和IFN-γ水平 肝移植術(shù)后各組血清IL-2和IFN-γ水平均無明顯差異（P＞0.05），而移植術(shù)后各組小鼠血清IL-2和IFN-γ水平均較術(shù)前顯著增高（P＜0.05）；但SOCS1-DC組小鼠兩種細(xì)胞因子與空白組及其他對照組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖3。

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)SOCS1的表達(dá)。

圖2 各組受體小鼠脾臟淋巴細(xì)胞混合反應(yīng)。

2.5 肝臟內(nèi)IL-2和IFN-γmRNA表達(dá) 肝移植術(shù)后imDC和DC-GFP組受體小鼠肝臟組織IL-2和IFN-γmRNA表達(dá)水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而DCSOCS1組兩種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)則顯著下降（P＜0.05），如圖4。

3 討論

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是惟一能夠激活初始T細(xì)胞反應(yīng)的抗原遞呈細(xì)胞，是決定T細(xì)胞反應(yīng)狀態(tài)的重要因素[7]。研究表明，DC是一類異質(zhì)性細(xì)胞群體，成熟DC因其表面高表達(dá)CD40、CD80等共刺激分子，因而能激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，表現(xiàn)出免疫原性；而未成熟DC表面不表達(dá)或者低表達(dá)共刺激分子，提呈抗原時(shí)因缺乏共刺激信號而誘導(dǎo)T細(xì)胞無能或凋亡，因而傾向誘導(dǎo)免疫耐受，表現(xiàn)出耐受原性[8]。近年來，較多研究嘗試多種方法抑制DC成熟，并利用這種不成熟DC回輸體內(nèi)誘導(dǎo)耐受，從而延緩或組織移植排斥反應(yīng)，這也是器官抑制領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[9]。SOCS1作為JAK-STAT信號途徑的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其對DC的成熟以及功能的調(diào)控以及引起研究者的廣泛注意。有研究發(fā)現(xiàn)，通過RNA感染技術(shù)沉默DC內(nèi)的SOCS1基因，可以增強(qiáng)DC的抗原呈遞功能，并增強(qiáng)腫瘤抗原特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)[10]。本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)上調(diào)DC中的SOCS1基因表達(dá)，以期能有效抑制DC的成熟而增強(qiáng)免疫耐受原性。

圖3 各組小鼠在手術(shù)前后血清IL-2和IFN-γ水平。

圖4 各組小鼠在手術(shù)前后肝臟組織IL-2和IFN-γmRNA表達(dá)。

筆者通過骨髓細(xì)胞體外條件培養(yǎng)法，分離獲得了較高純度的未成熟DC，并利用SOCS1基因的腺病毒轉(zhuǎn)染DC后，通過蛋白鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的DC顯著高表達(dá)SOCS1蛋白，因此提示通過腺病毒轉(zhuǎn)染SOCS1基因在DC中高表達(dá)的方法是可行的。通過進(jìn)一步將SOCS1基因高表達(dá)的DC細(xì)胞注入接受同種肝移植受體小鼠體內(nèi)，并分析其免疫功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DC-SOCS1免疫受者后，脾臟淋巴細(xì)胞對同種抗原的MLR活性顯著降低，提示受者淋巴細(xì)胞對同種抗原的反應(yīng)活性明顯下降，從而為介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)的免疫耐受、延長移植物存活期提供了基礎(chǔ)[11]。

大量實(shí)驗(yàn)表明，在排斥反應(yīng)發(fā)生過程中常伴有Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-2)的表達(dá)增高和Th2型細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10)的不表達(dá)或低表達(dá)，而在免疫耐受時(shí)，則呈相反的情況。IFN-γ不僅可以促進(jìn)Th型細(xì)胞分化為Th1型，同時(shí)通過誘導(dǎo)促炎癥因子分泌，激活炎癥細(xì)胞釋放各種效應(yīng)因子從而促進(jìn)排斥反應(yīng)，而IL-2作為重要的促炎癥因子，也在排斥反應(yīng)中起到了重要的作用。本研究顯示，同種異體肝移植術(shù)后，受體小鼠血清中IFN-γ及IL-2含量及在肝臟組織mRNA表達(dá)均較術(shù)前顯著增高；而SOCS1-DC免疫的受體小鼠，較對照組及空白組血清中IFN-γ及IL-2含量及在肝臟組織mRNA表達(dá)均有顯著的下降，因此提示SOCS1基因修飾的DC免疫治療在一定程度上成功誘導(dǎo)了免疫耐受，從而有望進(jìn)一步提高移植物存活率，這與以往體外研究中的結(jié)果也是相一致的[12]。

綜上所述，筆者的研究結(jié)果表明，SOCS1基因修飾的DC，用以體內(nèi)免疫同種異體肝移植受體小鼠，能有效減輕同種移植排斥反應(yīng)，并在一定程度上誘導(dǎo)形成免疫耐受。因此，進(jìn)一步基于SOCS1基因修飾的DC免疫治療策略對于誘導(dǎo)抑制免疫耐受具有重要的意義，也具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] Shen L,Evel-Kabler K,Strube R,et al.Silencing of SOCS1 enhancesantigen presentation by dendritic cells and antigen-specific anti-tumor immunity[J].Nat Biotechnol,2004,22(12):1546-1553.

[2] 陳曉波，秦杰，焦洋，等.小鼠SOCS1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生物進(jìn)展，2007，7（10）：1445-1448.

[3] Aldrich M,Sanders D,Lapteva N,et al.SOCS1 downregulation in dendritic cells promotes memory T-cell responses[J].Vaccine,2008,26(8):1128-1135.

[4] Chinen T,Komai K,Muto G,et al.Prostaglandin E2 and SOCS1 have a role in intestinal immune tolerance[J].Nat Commun,2011,2(190):1-11.

[5] Hashimoto M,Ayada T,Kinjyo I,et al.Silencing of SOCS1 in macrophages suppresses tumor development by enhancing antitumor inflammation[J].Cancer Sci,2009,100(4):730-736.

[8] 許英藝，陳玉強(qiáng).細(xì)胞因子信號抑制因子1在樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗中的作用[J].國際腫瘤雜志，2011，38（10）：729-733.

[7] Evel-Kabler K,Song XT,Aldrich M,et al.SOCS1 restricts dendritic cells ability to break self tolerance and induce antitumor immunity by regulating IL-12 production and signaling[J].J Clin Invest,2006,116(1):90-100.

[8] 王琪，林蘋，張沽，等.SOCS1對LIGHT誘導(dǎo)的骨髓來源DC分化成熟的影響[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2005，25(6)，456-459.

[9] Hanada T,Yoshida H,Kato S,et a1.Suppressor of cytokine signaling-1 is essential for suppressing dendritic cell activation and systemic autoimmunity[J].Immunity,2003,19(3):437-450.

[10] Hashimoto M,Ayada T,Kinjyo I,et al.Silencing of SOCS1 in macrophages suppresses tumor development by enhancing antitumor inflammation[J].Cancer Sci,2009,100(4):730-736.

[11] 王琪，林蘋，張潔，等.SOCSl對LIGHT誘導(dǎo)的骨髓來源DC分化成熟的影響[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2005，25（6）：456-459.

[12] Takagi H,Sanada T,Minoda Y,et al.Regulation Of cytokineand toll-like receptor signaling by SoCS family genes[J].Nippon Rinsho,2004,162(12):12189-2196.

Objective To study the effect on immune tolerance in heterotopic liver transplantation mode mice of Cytokine Signaling-1 (SOCS1)gene modifi ed dendritic cells (DC). Methods The adenovirus vectors containing suppressors of cytokine signaling-1 (SOCS1) was constructed.BALB/c mice was immunized with imDC, DC-GFP and DC-SOCS1, the serum level and the mRNA expression in liver of IL-2 and IFN-γ was detected. And mixture lymphocyte reaction (MLR) in spleen lymphocytes was observed in BALB/c mice. Results The adenovirus vectors containing SOCS1 was successfully constructed and tranfected. BALB/c mice immunized by DC-SOCS1 exhibited low reactive in spleen lymphocyte MLR (P＜0.05). Serm IL-2 and IFN-γ levels determined by ELISA in the DC-SOCS1 group increased signifi cantly after liver allograft transplantation,but was lower compared to control group and imDC,DC-GFP group (P＜0.05). The semiquantitative reversed transcriptase polymerase chain reaction assay showed that expression levels of IL-2 and IFN-γ in DC-SOCS1 mice also decreased markedly compared with other groups (P＜0.05). Conclusion Replication defective adenovirus vector SOCS1 can effectively transfect DC, and increase the expression of SOCS1 gene. Immunization with SOCS1 gene modifi ed immature DC in vivo can induce antigen-specifi c immune tolerance in organ transplantation.

Suppressors of cytokine signaling-1 (SOCS1); Dendritic cells; Transplantation; Graft rejection

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.25.001

廣東省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目 (2010B031600014)

510180 廣州市第一人民醫(yī)院危重癥監(jiān)護(hù)中心 （于曉春 羅時(shí)敏 黃昭 楊智 程園園 劉繼云）