林銳珊 蘇寧 趙平 吳紹鋒
黃芩苷對(duì)高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響
林銳珊 蘇寧 趙平 吳紹鋒
目的 探討不同劑量的黃芩苷對(duì)高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖的影響,以期探索黃芩苷防治DN的藥效機(jī)制,為中醫(yī)藥防治DN提供新的視角和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法 體外培養(yǎng)大鼠腎小球系統(tǒng)細(xì)胞(GMC)并分為9組:正常組(LG 5.5mmol/L)、模型組(HG 25mmol/L)、黃芩苷1組(HG 25mmol/L+黃芩苷3.125μmol/L)、黃芩苷2組(HG 25mmol/L+黃芩苷6.25μmol/L)、黃芩苷3組(黃芩苷(HG 25mmol/L+黃芩苷12.5μmol/L)、黃芩苷4組(HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L)、黃芩苷5組(HG 25mmol/L+黃芩苷50μmol/L)、黃芩苷6組(HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L)和PKC抑制劑組(HG 25mmol/L+ PKC抑制0.5 nmol/L),每組設(shè)平行6孔,培養(yǎng)24h、48h、72h后,應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)各組GMC增殖情況,倒置顯微鏡下觀察各組GMC生長(zhǎng)情況,評(píng)價(jià)黃芩苷對(duì)GMC生長(zhǎng)的影響。結(jié)果 從各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的OD值可見(jiàn),用藥組與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),黃芩苷組與PKC陽(yáng)性藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從抑制率可見(jiàn),24h時(shí),除了黃芩苷6組(即給藥劑量為100μmol/L)對(duì)高糖刺激后GMC增殖有抑制作用之外,其余各組對(duì)高糖刺激后GMC增殖均無(wú)抑制。48h、72h隨著時(shí)間增加,各組對(duì)高糖刺激后GMC增殖的抑制率逐漸升高,且隨著黃芩苷濃度增加抑制率逐漸增高。結(jié)論 高糖環(huán)境下,體外培養(yǎng)GMC存在異常增殖現(xiàn)象,黃芩苷對(duì)高糖刺激GMC增殖有抑制作用,且具有一定劑量效應(yīng)關(guān)系。即抑制率隨著黃芩苷濃度的增高而升高,尤其是25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三組的時(shí)間劑量依賴(lài)關(guān)系更加明顯,且在72h的時(shí)間點(diǎn)抑制率最高,抑制效果最佳。
腎小球系膜細(xì)胞;黃芩苷;高糖環(huán)境;增殖
黃芩苷(Baicalin Bai)是從清熱解毒中藥黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)中提取的一種黃酮類(lèi)化合物,具有抗菌、消炎和抗氧化等藥理作用[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷具有防治DN的作用[3-4]。為進(jìn)一步探討黃芩苷防治DN的機(jī)制,我院實(shí)驗(yàn)室課題組研究了黃芩苷不同藥物濃度對(duì)高糖環(huán)境下的腎小球系膜細(xì)胞增殖的抑制情況,以期探索黃芩苷防治DN的藥效機(jī)制,為中醫(yī)藥防治DN提供新的視角和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠腎小球系膜細(xì)胞株(HBZY-1);購(gòu)于湖北省博士德生物有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 黃芩苷(純度為98%):購(gòu)于南京青澤醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司;PKC抑制劑,購(gòu)于碧云天生物有限公司,高、低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶溶液、噻唑藍(lán)、二甲基亞楓均購(gòu)于美國(guó)GIBGO公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱,超凈工作臺(tái),倒置顯微鏡,高速臺(tái)式離心機(jī),超純水系統(tǒng),全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為9組,分別為:正常組(LG5.5mmol/L)、模型組(HG 25mmol/L)、黃芩苷1組(HG 25mmol/L+黃芩苷3.125μmol/L)、黃芩苷2組(HG 25mmol/L+黃芩苷6.25μmol/L)、黃芩苷3組(黃芩苷(HG 25mmol/L+黃芩苷12.5μmol/L)、黃芩苷4組(HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L)、黃芩苷5組(HG 25mmol/L+黃芩苷50μmol/L)、黃芩苷6組(HG 25mmol/L+黃芩苷100μmol/L)和PKC抑制劑組(HG 25mmol/L+ PKC抑制0.5nmol/L),每組6孔。
1.4.2 MTT法檢測(cè)黃芩苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響方法:選取經(jīng)培養(yǎng)3~5代的腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用0.25%胰酶溶液消化,制成細(xì)胞混懸液,并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),把細(xì)胞混懸液調(diào)至2×104/mL的細(xì)胞濃度。然后,往96孔板加入細(xì)胞混懸液,每孔加入100μL,共鋪3板,四圍用PBS封閉,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,同步化后,按照原設(shè)計(jì)分組,加入200μL/孔的相應(yīng)濃度的溶液,空白組加DMEM/F12(含10%FCS),模型組加入25mmol/L的DMEM/F12,其余各組均加入用25mmol/L的DMEM/F12配制的相應(yīng)濃度的藥物溶液,原條件繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h、48h、72h后,加入MTT20μL/孔,于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4h后,吸去MTT液,加入DMSO 150μL/孔,振蕩10min,用酶標(biāo)儀觀察,在492nm波長(zhǎng)處記錄吸光度OD值,空白孔調(diào)零。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間使用單方向方差χ2分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 不同時(shí)間點(diǎn)高糖對(duì)GMC增殖作用的影響 高糖組在24h、48h、72h的吸光值均較低糖組增高(P<0.05),且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增高明顯。根據(jù)OD值計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均增殖率,可見(jiàn)高糖刺激后GMC在24h、48h、72h的增殖率呈逐漸增大趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,25mmol/L的高糖對(duì)GMC增殖有促進(jìn)作用,且呈時(shí)間依賴(lài)性,見(jiàn)表1。的增殖后就會(huì)出現(xiàn)接觸抑制,而容易出現(xiàn)如Andrea C、魏吉林等研究證實(shí)的高糖狀態(tài)下,GMC增殖先促進(jìn)后抑制的現(xiàn)象[8-9]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,在進(jìn)行MTT檢測(cè)GMC增殖狀況之前,選用了三種不同的接種濃度,根據(jù)測(cè)出的生長(zhǎng)曲線,認(rèn)為GMC最佳接種濃度為2×104/mL,因此排除了因細(xì)胞濃度過(guò)高產(chǎn)生自我接觸抑制的可能。
表1 不同濃度葡萄糖環(huán)境下GMC不同時(shí)間點(diǎn)OD值(±s)
表1 不同濃度葡萄糖環(huán)境下GMC不同時(shí)間點(diǎn)OD值(±s)
注:與正常組比較,aP<0.05,bP<0.01。
組別 例數(shù) 不同時(shí)間點(diǎn)OD值24h 48h 72h正常組 6 0. 339±0.021 0.544±0.024 0.908±0.025模型組 6 0.352±0.031a 0.586±0.072a 1.017±0.046b
目前,體外實(shí)驗(yàn)研究關(guān)于黃芩苷對(duì)細(xì)胞的抑制作用,很少涉及到其對(duì)GMC增殖的影響。本實(shí)驗(yàn)采用濃度梯度劑量作用于GMC,最小劑量為3.325μmol/L、最大劑量100μmol/L。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),黃芩苷對(duì)體外培養(yǎng)的GMC增殖具有一定抑制作用,且呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。黃芩苷和PKC抑制劑在24h以前未發(fā)生抑制,此時(shí)間段,以高糖刺激作用為主。24h后,黃芩苷和PKC抑制劑均對(duì)高糖刺激GMC增殖有抑制作用,且具有一定劑量效應(yīng)關(guān)系。即抑制率隨著黃芩苷濃度的增高而升高,尤其是25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三組的時(shí)間劑量依賴(lài)關(guān)系更加明顯、穩(wěn)
表2 不同組不同時(shí)間點(diǎn)OD值和抑制率(±s;n=6)
表2 不同組不同時(shí)間點(diǎn)OD值和抑制率(±s;n=6)
注:與模型組比較,aP<0.05,b與PKC陽(yáng)性藥組比較P<0.05;λ=492。
不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率(%)24h 48h 72h 24h 48h 72h模型組 - 0.352±0.031 0.586±0.072 1.017±0.046a — — —黃苓苷1組 3.125μmol/L 0.331±0.024 0.547±0.040 0.935±0.127b -6.01 6.49 8.03黃苓苷2組 6.25μmol/L 0.377±0.016 0.598±0.028 0.948±0.073ab -7 -2.19 7黃苓苷3組 12.5μmol/L 0.392±0.039 0.609±0.048 0.932±0.064ab -11.26 -4.09 8.29黃苓苷4組 25μmol/L 0.399±0.038a 0.570±0.036ab 0.790±0.062ab -13.35 2.56 22.23黃苓苷5組 50μmol/L 0.389±0.022a 0.563±0.053ab 0.656±0.022ab -10.41 3.81 35.47黃苓苷6組 100μmol/L 0.377±0.039a 0.498±0.049ab 0.592±0.022ab 7.10 14.99 41.71 PKC陽(yáng)性藥組 0.5nmol/L 0.289±0.028 0.340±0.034b 0.407±0.023b -17.76 41.93 59.96組別 藥物劑量 不同時(shí)間點(diǎn)OD值
2.2 黃芩苷對(duì)高糖環(huán)境下GMC增殖的抑制作用的比較從表2各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的OD值可見(jiàn),用藥組與高糖組比較均有差異,但黃芩苷3.25μmol/L、6.25μmol/L差異不顯著,其它各組差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),黃芩苷組與PKC陽(yáng)性藥組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
從抑制率可見(jiàn),24h時(shí),除了黃芩苷6組(即給藥劑量為100μmol/L)對(duì)高糖刺激后GMC增殖有抑制作用之外,其余各組對(duì)高糖刺激后GMC增殖均無(wú)抑制。48h、72h隨著時(shí)間增加,各組對(duì)高糖刺激后GMC增殖的抑制率逐漸升高,且隨著黃芩苷濃度增加抑制率逐漸增高。
糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy,DN)是指糖尿病(Diabetes mellitus,DM)時(shí)發(fā)生的腎小球、腎小管、腎間質(zhì)和腎血管病變[5]。GMC是一種腎小球固有細(xì)胞,屬于間質(zhì)細(xì)胞,在腎臟細(xì)胞和生理功能方面發(fā)揮重要作用。DN早期可見(jiàn)GMC肥大,數(shù)量增多,并由此導(dǎo)致腎小球高濾過(guò)狀態(tài)、ECM積聚和基底膜增厚,繼而產(chǎn)生一系列反應(yīng),最終導(dǎo)致腎小球毀損、硬化。可見(jiàn),GMC的病理變化在DN的發(fā)生和發(fā)展中居于中心地位[6]。有研究證實(shí),減少ECM的積聚,拮抗細(xì)胞因子的不良作用,抑制GMC的增殖活化是防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)[7]
高糖是DN發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)因素,高糖對(duì)GMC增殖作用的影響,由于不同研究使用的方法不同,且在用MTT進(jìn)行檢測(cè)時(shí),接種細(xì)胞的濃度不同,結(jié)果也有差異。接種密度過(guò)大,細(xì)胞經(jīng)過(guò)短暫定,且在72h的時(shí)間點(diǎn)抑制率最高,抑制效果最佳。
[1] 康杰芳,任婷婷.中藥黃芩的研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,55(4):128-133.
[2] 藍(lán)遠(yuǎn)強(qiáng),石桂英.黃芩苷片治療慢性肝病36例臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2008,6(6):184-186.
[3] 蘇寧,周樂(lè)全,匡忠生,等.黃芩苷下調(diào)TGF-β1、PKC表達(dá)減少腎小管IV-C沉積的作用[J].中藥新藥與臨床藥理,2008,19(4):272-274.
[4] 蘇寧,李豐,趙平,等.黃芩苷調(diào)節(jié)DN大鼠腎臟局部生物活性物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(1):22-24.
[5] 陳明,李珺.糖尿病腎病的發(fā)燕尾服機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2009,4(5):234.
[6] Gomez-GuerreroC,Heng,WEN Kai-hui,et al.The XTT colorimetric assay measuring the cell groeth curve[J].Med J Nat Def Force North China,2007,19(4):7.
[7] Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics[J].Kidney Int,2006,69(2):213-217.
[8] Andrea C S,Bruce MH.The regulation of mesangial cell proliferation[J].Nephron Exp Nephrol,2008,108(4):74-79.
[9] 魏吉林,李偉,李雪俠.靈芝對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008,9(1):61-62.
10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.100
廣州中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目 (10CX073)
510006 廣州中醫(yī)藥大學(xué)西醫(yī)基礎(chǔ)公共實(shí)驗(yàn)室 (林銳珊 蘇寧吳紹鋒) 510000 廣州益善生物技術(shù)有限公司 (趙平)
蘇寧 E-mail:sunning@gzhtcm.edu.cn