陶 芳 程備久

玉米抗黃曲霉毒素污染的研究進(jìn)展

陶 芳 程備久

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036)

黃曲霉毒素污染是影響玉米食用安全的重要因素。篩選培育玉米抗性品種，從源頭控制黃曲霉的侵染，是解決玉米田間及儲(chǔ)存期黃曲霉污染的有效方法。對(duì)國(guó)內(nèi)外玉米黃曲霉抗原種質(zhì)的篩選鑒定、分子標(biāo)記輔助選育及部分抗性機(jī)理等方面的研究進(jìn)行了概述，并就目前存在的一些問(wèn)題，探討了我國(guó)玉米抗黃曲霉的研究方向。

抗黃曲霉 玉米抗原種質(zhì) 輔助選育 抗性機(jī)理

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A．parasiticus)和集蜂曲霉(A．nomious)等曲霉菌產(chǎn)生的具有生物活性的二次代謝產(chǎn)物［1］，主要包括:AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，其中AFB1是目前已發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的一類化學(xué)致癌物，其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥，是導(dǎo)致人體肝癌、鼻咽癌的主要病源之一，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為1A類致癌物［2］。黃曲霉是產(chǎn)毒曲霉中的優(yōu)勢(shì)菌種，分泌AFB1、AFB2兩種毒素，常侵染玉米、花生、大米、棉籽等糧油作物及其制品，并通過(guò)食物鏈對(duì)家畜、動(dòng)物和人類健康構(gòu)成極大的潛在危害。據(jù)世界糧農(nóng)組織估計(jì)，全世界每年約有25%的食用作物由于真菌毒素污染(主要代表性毒素是AFB1)而不能食用。

玉米是我國(guó)主要的食用兼飼用的作物，受到黃曲霉毒素污染的玉米籽粒，通過(guò)玉米食品及深加工產(chǎn)品，如動(dòng)物飼料、淀粉、玉米油、玉米食品等，給人體和動(dòng)物的健康造成危害。據(jù)高秀芬等［3］2011年調(diào)查統(tǒng)計(jì)表明我國(guó)玉米的黃曲霉毒素污染比較普遍，以AFB1污染為主，南方黃曲霉病陽(yáng)性率達(dá)到90%以上。黃曲霉菌侵染作物有兩種途徑:一是田間作物抽穗期，由于病蟲(chóng)危害、土壤貧瘠、干旱等引發(fā)的穗部侵染;二是由于種子收獲后儲(chǔ)存條件不當(dāng)造成的。所以其防治難度較大，為了減輕黃曲霉菌對(duì)玉米的污染，主要從兩方面進(jìn)行研究:一是提高玉米的抗性以預(yù)防侵染，二是對(duì)已被污染的玉米進(jìn)行生物脫毒。對(duì)于后者人們?cè)谖⑸锛捌浯紊x物、植物次生代謝物、脫毒酶等方面進(jìn)行了廣泛的研究，雖取得了一些進(jìn)展，但因?yàn)閼?yīng)用面狹窄、或成本高、或因?yàn)槭称钒踩珕?wèn)題無(wú)法應(yīng)用。而提高玉米的抗性，從源頭控制黃曲霉的侵染是較為經(jīng)濟(jì)、切實(shí)可行的方法。

1 玉米抗黃曲霉種質(zhì)的篩選

美國(guó)是玉米主產(chǎn)國(guó)，開(kāi)展抗黃曲霉的遺傳與育種已多年，培育出了多個(gè)抗黃曲霉的自交系。Williams等從1970年開(kāi)始對(duì)玉米抗黃曲霉的種質(zhì)進(jìn)行篩選，1988年首次選育并發(fā)放了抗黃曲霉自交系Mp313E，之后分別于1991、1999年發(fā)放了 Mp420、Mp715 等抗原種質(zhì)［4－5］。McMillian 等［6］1993 年從一個(gè)感病的玉米果穗中選出并合成的抗黃曲霉群體GT－MAS:gk，也已在美國(guó)作為抗原種質(zhì)而發(fā)放利用。在我國(guó)，有關(guān)黃曲霉菌的抗性遺傳與育種的工作開(kāi)展得極少。鄧德祥等［7］1999年對(duì)89個(gè)玉米自交系進(jìn)行篩選，得到1個(gè)高抗品系，2002年對(duì)145個(gè)玉米自交系進(jìn)行篩選，得到8個(gè)高抗品系［8］。2008年李洪等［9］將從國(guó)外引進(jìn)的GT－MAS:gk進(jìn)行了配合力效應(yīng)測(cè)定，為我國(guó)的玉米抗黃曲霉育種工作提供了有益的參考。目前我國(guó)尚無(wú)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的玉米抗黃曲霉種質(zhì)發(fā)放。

黃曲霉抗性種質(zhì)資源篩選方法上，國(guó)外已應(yīng)用含GUS或GFP基因的黃曲霉菌在室內(nèi)進(jìn)行快速高效的抗性評(píng)價(jià)技術(shù)體系kernel screening assay(KSA)［10－11］。它不僅有利于直觀而精確地評(píng)價(jià)侵染程度、毒素水平，并有助于了解抗性種質(zhì)影響黃曲霉生長(zhǎng)和毒素合成的機(jī)理。在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

2 分子標(biāo)記輔助育種

近些年，分子標(biāo)記已在基因定位(QTL定位)、種質(zhì)資源鑒定以及標(biāo)記輔助選擇育種方面起到重要作用。玉米對(duì)黃曲霉的抗性也屬數(shù)量遺傳性狀，其田間抗性與儲(chǔ)存期的抗性基本一致。以高抗和高感黃曲霉的材料為基礎(chǔ)，采用分子標(biāo)記輔助育種，并進(jìn)行基因定位，為抗黃曲霉的育種工作提供了重要的理論依據(jù)。如White等［12］用RFLP技術(shù)分析了3個(gè)抗病材料 R001、LB31和 Tex6，2個(gè)感病材料 B73和Mo17，將與抗黃曲霉病相關(guān)的基因定位于染色體2L，3L，4S，and 8S。此外，SSR 標(biāo)記技術(shù)比 RFLP 標(biāo)記多態(tài)性更高，現(xiàn)也被廣泛用于玉米抗黃曲霉基因定位。Brooks等［13］以 Mp313E(R)和 B73(S)為親本進(jìn)行SSR標(biāo)記，定位得到2個(gè)QTL，一個(gè)位于2號(hào)染色體，命名為all3，可以解釋表型變異的7．18%;另一個(gè)QTL位點(diǎn)命名為aft5，位于4號(hào)染色體，可以解釋表型變異的8．18%。并指出:玉米黃曲霉菌的抗性在自然條件下主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)，并且2個(gè)抗性QTL區(qū)域在3個(gè)不同的環(huán)境下依然表現(xiàn)出顯著的抗性效應(yīng)。

QTL定位不僅與所用的親本有關(guān)，環(huán)境因素對(duì)之也產(chǎn)生較大的影響，如表1所示［16］。

3 玉米抗黃曲霉相關(guān)蛋白R(shí)APs

玉米抗性種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為探索其抗性機(jī)理提供了資源，其中之一便是對(duì)玉米抗黃曲霉相關(guān)蛋白R(shí)APs(Resistance－Associated Proteins)的挖掘。

在玉米籽粒中較早發(fā)現(xiàn)的RAPs有萌發(fā)誘導(dǎo)核糖體失活蛋白R(shí)IP(germination－induced ribosome inactivating protein)和小分子抗真菌蛋白 zeamatin［18］，前者主要起修飾和失活外源核糖體作用，后者則通過(guò)增加真菌細(xì)胞膜的通透性而起作用。

植物在受到外源病源菌侵染時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列抗性反應(yīng)，并隨之產(chǎn)生和積累一種或幾種RAPs蛋白，即所謂的病程相關(guān)蛋白 PR(pathogenesis－related proteins)。已有研究表明PR蛋白在不同的植物中表現(xiàn)不同，可以為幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制劑、過(guò)氧化物酶等。玉米在受到黃曲霉侵染時(shí)也有類似表現(xiàn)。如Huang等［19］發(fā)現(xiàn)玉米自交系Tex6籽粒中有2個(gè)蛋白與黃曲霉抗性相關(guān)，一個(gè)分子質(zhì)量為28 ku，它能抑制黃曲霉的生長(zhǎng);另一個(gè)分子質(zhì)量高于100 ku，對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)抑制作用不大，但能抑制其產(chǎn)毒。后來(lái)的研究表明28 ku為一種獨(dú)特的幾丁質(zhì)酶［20］。籽粒中還有一種14 ku的胰蛋白酶抑制劑TI(trypsin inhibitor protein)，在抗性玉米中含量高于非抗性材料［21－23］。Baker等［24］從玉米胚乳 cDNA 文庫(kù)中克隆了另一胰蛋白酶抑制劑ZmTIp，為10 ku，研究表明它能影響黃曲霉的生長(zhǎng)，但其作用弱于TIs。Ji等［25］在被侵染的成熟玉米籽粒中檢測(cè)到β－1，3－葡聚糖酶同工酶也與抗性相關(guān)。

蛋白質(zhì)組學(xué)方法的應(yīng)用為尋找玉米籽粒與黃曲霉抗性相關(guān)的蛋白 RAPs提供了捷徑。Chen等［26－28］通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法在玉米胚及胚乳中發(fā)現(xiàn)與黃曲霉抗性相關(guān)的蛋白，主要分為4類:(1)貯存蛋白，如球蛋白(GLB1，GLB2)，胚晚期富集蛋白(LEA3，LEA14);(2)脅迫反應(yīng)蛋白:醛糖還原酶(ALD)，乙二醛酶(GLX)，熱擊蛋白(HSP17．2);(3)抗真菌蛋白，包括胰蛋白酶抑制因子TI;(4)調(diào)節(jié)蛋白。

在上述提及的RAPs中，有一些已被進(jìn)一步研究與黃曲霉抗性的關(guān)系，如:PR10蛋白(16～19 kD)具核酸酶相似結(jié)構(gòu)(馬鈴薯、西芹和苜蓿無(wú)體外核酸酶活性)及抗菌特性，部分研究表明它還有提高植物的耐鹽性的功能，可能是一個(gè)對(duì)生物脅迫和非生物脅迫均有應(yīng)答反應(yīng)的蛋白。Chen等研究表明PR10基因在抗原種質(zhì)GT－MAS:gk中受黃曲霉誘導(dǎo)表達(dá)，但在感病材料Mo17中不表達(dá)。在授粉后的7～22 d內(nèi)，受黃曲霉誘導(dǎo)，抗性材料胚乳中的PR－10增加了5倍［29］;通過(guò)RNAi使玉米愈傷組織中的PR10蛋白降低了65%～99%，其籽粒較對(duì)照易受黃曲霉侵染［30］。Xie等［31］發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)與 PR10 高度同源的ZmPR10．1，二者主要在根組織中表達(dá)，且前者表達(dá)量高于后者，但在E．coli中異源表達(dá)的ZmPR10．1的RNase活性是ZmPR10的8倍，其對(duì)黃曲霉的抗性高于ZmPR10。

醛糖還原酶ALD(aldose reductase)，在玉米抗性材料胚組織中表達(dá)量高于敏感材料。乙二醛酶GLX－I(glyoxalase I)，胚組織表達(dá)的GLX－I，和 GLX II一起參與cytotoxic methylglyoxa形成D－乳酸，對(duì)植物的脅迫反應(yīng)非常重要，黃曲霉侵染后的抗性玉米籽粒中的GLX－I活性明顯高于非抗性材料［32］。抗氧化蛋白PER1(peroxiredoxin antioxidant protein1)，屬1－cys酶，以谷胱甘肽為電子供體。胚乳中表達(dá)的PER1明顯受黃曲霉誘導(dǎo)，在籽粒發(fā)育晚期抗性材料明顯高于感病材料［27］。凝集素樣蛋白ZmCORp(lectin－like protein)，是通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的又一與黃曲霉抗性相關(guān)的蛋白，它在玉米抗性材料中的表達(dá)是敏感材料的兩倍多［33］。這一蛋白也已在辣椒［34］、扁豆［35］中發(fā)現(xiàn)與抗黃曲霉病相關(guān)。

除玉米籽粒之外，玉米其他組織中與黃曲霉抗性相關(guān)的蛋白也不斷地被發(fā)現(xiàn)。如對(duì)玉米花軸及花絲的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，抗性玉米花軸含有較高水平的非生物脅迫相關(guān)蛋白和苯丙烷類代謝相關(guān)蛋白［36］;Peethambaran 等［37］的研究表明抗性材料的花絲中與抗黃曲霉相關(guān)的蛋白是幾丁質(zhì)酶，有3種幾丁質(zhì)酶PRm3、I、A在抗性材料中差異表達(dá)。

隨著玉米B73基因組數(shù)據(jù)的釋放，一些通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析獲得的RAP蛋白基因已進(jìn)行了染色體定位，包括了上述 QTL 定位提及的 1，2，3，7，8，10 號(hào)染色體［38］。人們發(fā)現(xiàn)不同的抗性種質(zhì)存在不同的抗性相關(guān)基因，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行基因定位或從相關(guān)的基因作圖中獲取信息將越來(lái)越重要。

4 玉米抗黃曲霉病基因轉(zhuǎn)錄分析

Morris等［39］從被侵染玉米葉片中發(fā)現(xiàn)2個(gè)快速而高效表達(dá)的基因PR－1 and PR－5 genes。

Kelley等［40］用 Unigene 1－1．05 arrays比較分析了抗性材料Mp313E和敏感材料Va35在黃曲霉侵染48h后的基因轉(zhuǎn)錄情況，Va35和Mp313E中分別有135和112個(gè)基因上調(diào)，其中有12個(gè)基因在兩種材料中均上調(diào)，有1個(gè)基因在兩種材料中均下調(diào)。

Luo等［41］通過(guò)Microarry分析玉米籽粒被侵染72 h后的基因轉(zhuǎn)錄情況，表明無(wú)論是抗性材料還是非抗性材料，玉米籽粒在黃曲霉侵染時(shí)均啟動(dòng)了復(fù)雜的防御體系。在抗性材料Eyl25和敏感材料Eyl31中分別檢測(cè)到6 955和6 565個(gè)基因，其中在抗性材料中有214個(gè)基因是誘導(dǎo)表達(dá)，在敏感材料中有2 159個(gè)基因被誘導(dǎo)。

隨著玉米抗黃曲霉研究的不斷深入，其有關(guān)信息量也不斷加大。美國(guó)密西西比州立大學(xué)Kelley等［42］整合了現(xiàn)有的玉米中與黃曲霉抗性相關(guān)的QTL遺傳圖譜數(shù)據(jù)、幼穗microarray基因表達(dá)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析數(shù)據(jù)及 SNP，建立了 CFRAS－DB(The Corn Fungal Resistance Associated Sequences Database)(http://agbase．msstate．edu/)，并將進(jìn)一步整合RNASeq dataset，以挖掘更多的玉米抗黃曲霉基因。

5 氧脂質(zhì)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

病原菌侵染宿主是一個(gè)相互作用的過(guò)程。美國(guó)Texas A＆M大學(xué)的Kolomiets MV實(shí)驗(yàn)室則從另一角度探索玉米易感黃曲霉病的原因，并試圖找到玉米抗黃曲霉病的新途徑。早期就有研究表明黃曲霉易感染含油量高的種子或種胚(如花生、玉米、大豆、水稻)，且脂肪酸的不飽和度越高，越易感染黃曲霉。該實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為玉米對(duì)黃曲霉的抗性強(qiáng)弱與脂肪酸代謝途徑有關(guān)，因?yàn)椴伙柡投仍礁?，脂肪酸越易被氧化，產(chǎn)生過(guò)氧脂質(zhì)，而過(guò)氧脂質(zhì)可能與黃曲霉的侵染有關(guān)［43］。該研究組從玉米中相繼克隆了 ZmLOX3、ZmLOX4、ZmLOX5、ZmLOX6 等脂氧合酶基因，它們均與黃曲霉抗性有關(guān)，但表現(xiàn)各有差異，其中的Zm-LOX3 失活表現(xiàn)為感?。?4－47］。

Wisconsin大學(xué)的Brodhagen M等［48］提出了過(guò)氧脂質(zhì)作為信號(hào)分子參與黃曲霉侵染宿主的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，認(rèn)為過(guò)氧脂質(zhì)的產(chǎn)生可以由玉米的脂氧合酶LOX也可由黃曲霉自身的脂氧合酶Ppo催化合成，它們可能接合于黃曲霉菌細(xì)胞膜上的GPCR(G蛋白偶聯(lián)受體)，進(jìn)入 G 蛋白信號(hào)通路［49－50］。

其實(shí)GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在哺乳動(dòng)物中廣泛存在，人類基因組中約有720個(gè)基因參與了GPCR的合成，而且接近50%的藥物是用GPCR作為它們的靶標(biāo)，在藥物的高通量篩選中起重要作用。2002年在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)與過(guò)氧脂質(zhì)結(jié)合的GPCR。如果植物與病原菌相互作用時(shí)依賴過(guò)氧脂質(zhì)受體GPCR，且這條信號(hào)通路在植物與霉菌的相互作用中起到關(guān)鍵作用的話，是可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因來(lái)調(diào)控GPCR以達(dá)到防治的目的。Wisconsin大學(xué)的Keller教授也正在以構(gòu)巢曲霉為模式生物進(jìn)行這項(xiàng)工作。

6 結(jié)語(yǔ)

玉米是世界上重要的谷類作物，其在畜牧業(yè)、軟飲料、工業(yè)等多領(lǐng)域所體現(xiàn)出的可加工性使其在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中愈來(lái)愈具有重要的價(jià)值，但是玉米作為黃曲霉的易感宿主，極易將黃曲霉毒素這一強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)帶入食物鏈，危害人、畜的健康安全，從而給這些領(lǐng)域的應(yīng)用增加了阻力。開(kāi)展玉米抗黃曲霉遺傳育種工作，探明玉米抗黃曲霉的遺傳及機(jī)制，進(jìn)而培育出抗黃曲霉的品種是解決黃曲霉對(duì)玉米污染的根本方法。國(guó)外雖然對(duì)玉米黃曲霉抗原種質(zhì)的鑒定篩選、抗病育種、遺傳分析及抗性機(jī)理的研究等方面進(jìn)行了的研究，取得了一些成效，但還未發(fā)現(xiàn)對(duì)黃曲霉侵染和產(chǎn)毒具有顯著抗性的物質(zhì)或有效基因。而我國(guó)在這方面的工作則非常欠缺，因此，如何充分利用現(xiàn)有及引進(jìn)的資源，發(fā)掘并創(chuàng)制新的抗性種質(zhì)，建立快速高效的抗性評(píng)價(jià)技術(shù)體系，開(kāi)發(fā)與抗性相關(guān)的分子標(biāo)記輔助選育，并進(jìn)行相關(guān)抗性機(jī)理的研究將是今后的工作重點(diǎn)。

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Advances in the Development of Maize Resistance to Aflatoxin Contamination

Tao Fang Cheng Beijiu
(School of Life and Science，Anhui Agruicultural University，Hefei 230036)

Aflatoxins contamination significantly affects the food safety of maize industry．Development of aflatoxin－ resistant commercial maize lines is probably the best and most widely explored strategy．This review will present information on the following areas:Identification of new sources of maize resistant germplasm;development resistance markers to aid in marker－assisted maize breeding and resistance mecha-nism study of maize against Aspergillus flavus．The problems in maize resistance to aflatoxin and further research efforts were discussed．

aflatoxin－resistance，maize resistant germplasm，marker－assisted breeding，resistance mecha-nism

S513;S332．2

A

1003－0174(2012)05－0112－06

安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2012 A106)

2011－09－02

陶芳，女，1970年出生，副教授，碩士生導(dǎo)師，作物遺傳育種