夏 利 程培華 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 桂林 541001)

優(yōu)化單純皰疹病毒DNA疫苗的研究進展

夏 利 程培華 (桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西 桂林 541001)

單純皰疹病毒;HSV-DNA疫苗;生殖器皰疹

單純皰疹病毒(HSV)是生殖器皰疹(GH)的主要病原體，主要通過性接觸傳播。HSV感染機體后可長期潛伏在骶神經(jīng)節(jié)中，逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別，因而無法徹底清除。在一定條件如應(yīng)激、疲勞、免疫力低下等情況下，潛伏病毒被激活而發(fā)病，其復(fù)發(fā)率可高達80%。GH易復(fù)發(fā)、不易治愈的傾向與患者免疫功能紊亂有關(guān)，抗病毒聯(lián)合免疫治療雖然取得了明顯療效，但是不能有效預(yù)防HSV感染，控制潛伏，減少復(fù)發(fā)。另外，其服藥時間長，停藥后易復(fù)發(fā)，加重了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，目前沒有能夠控制其復(fù)發(fā)的特效藥。研制有效的HSV-DNA疫苗成為防治HSV感染的理想方法。如何優(yōu)化HSV-DNA疫苗，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量的實驗研究，并取得了一定進展，但目前仍無一種人用HSV-DNA疫苗面世。本文對近年來優(yōu)化HSV-DNA疫苗的研究進展做一綜述。

1 HSV-DNA疫苗簡介

DNA疫苗是伴隨現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來的新型疫苗，是繼第一代減毒活疫苗和第二代亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗。DNA疫苗是將編碼某種蛋白的外源基因片段克隆到真核表達質(zhì)粒，再用該DNA免疫動物，抗原編碼基因能夠在宿主體內(nèi)表達，并刺激產(chǎn)生針對該抗原蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。引入的外源基因可以在體內(nèi)長期存在，并不斷表達外源蛋白，持續(xù)的刺激機體免疫系統(tǒng)，因此，微量的DNA疫苗即可刺激產(chǎn)生強而持久的免疫應(yīng)答。HSV感染是一個極其復(fù)雜的過程，機體的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫共同參與防御。HSV-DNA疫苗能高效、穩(wěn)定誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴(CTL)效應(yīng)，并且可以共表達免疫調(diào)節(jié)因子，根據(jù)需要誘導(dǎo)產(chǎn)生最適免疫應(yīng)答，較其他疫苗更有優(yōu)勢，且安全性更高。加之DNA的易操作性，使HSV-DNA疫苗備受青睞。

包膜糖蛋白參與HSV病毒吸附、入胞、融合、出胞等全過程，是GH發(fā)病的關(guān)鍵所在。在已知的11種包膜糖蛋白中，糖蛋白D(Gly coprotein D，gD)是高度保守的蛋白，與其他亞群同源性高，具有同種異株的交叉保護作用。同時gD具有較強的免疫原性，是產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白，能誘導(dǎo)特異抗HSV抗體產(chǎn)生及活性增強，抑制和中和HSV，從而控制復(fù)發(fā)。gD是特異性CTL識別位點，可誘導(dǎo)強大的CTL效應(yīng)。gD具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，因此 HSV-DNA疫苗是目前研究熱點。Cooper等〔1〕認(rèn)為HSV-2gD是制備HSV-DNA疫苗的最佳選擇。gD-DNA疫苗免疫豚鼠可產(chǎn)生高滴度的中和抗體，使HSV失活，減少HSV形成潛伏感染的機會，從而有效降低其復(fù)發(fā)率。

近年來人們開始關(guān)注早期表達蛋白(ICP)，并將其作為候選蛋白。Haynes等〔2〕通過HSV-2 ICP27聯(lián)合大腸桿菌耐熱腸毒素(LT)，共免疫小鼠并進行攻擊試驗，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)出ICP27特異性免疫反應(yīng)，并可使小鼠免受致死量HSV-2的攻擊。

HSV-DNA疫苗因具有多種優(yōu)點而備受關(guān)注，各種新型HSV-DNA疫苗已經(jīng)成功構(gòu)建，并且免疫動物效果也很明顯，但其臨床試驗效果并不如意。國內(nèi)外學(xué)者致力于尋找其原因，并探求優(yōu)化HSV-DNA疫苗，已取得一定進展。

2 增強疫苗免疫原性

2.1 免疫佐劑 某些物質(zhì)若先于抗原或與抗原一起注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑。將一些編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒，如IL-2、IL-12、IL-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSFL)等與DNA疫苗共同轉(zhuǎn)錄后可起到免疫佐劑作用，其被體內(nèi)細(xì)胞攝取后表達的免疫刺激因子能夠較長時間刺激免疫活性細(xì)胞，大大強化了gD蛋白誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫。

Th1細(xì)胞在機體抗HSV胞內(nèi)感染中發(fā)揮重要作用。微環(huán)境中細(xì)胞因子的種類是影響Th細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。在諸多的細(xì)胞因子中，IL-12起關(guān)鍵作用，有利于Th0向Th1細(xì)胞分化。IL-12可能成為最重要的免疫佐劑。Sin等〔3〕用編碼HSV-2gD的質(zhì)粒與編碼IL-12P40和IL-12P35的質(zhì)粒共注射免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)出高水平的IgA、IgG和IgE，體液免疫明顯增強，同時T細(xì)胞增殖實驗表明，細(xì)胞免疫也明顯增強，共注射可顯著提高刺激指數(shù)。

2.2 CTL表位 以CTL為主的細(xì)胞免疫是抗HSV感染的重要組成部分。CTL表位可誘導(dǎo)有效CTL效應(yīng)，中和HSV顆粒，直接殺傷感染靶細(xì)胞，成為特異性細(xì)胞免疫重要效應(yīng)細(xì)胞之一。因而，CTL為主的細(xì)胞免疫作為優(yōu)勢應(yīng)答逐漸受到重視。

CTL表位是內(nèi)源性抗原經(jīng)APC加工、由MHC分子提呈給TCR的短肽，是介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部位，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時也能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答〔4〕。楊慧蘭等〔5〕構(gòu)建的pVAX-gD-CTL添加了特異CTL表位基因，并在小鼠體內(nèi)成功激活出有效的CTL效應(yīng)，其研究結(jié)果表明gD CTL表位的加入明顯提高了CTL的活性，促進小鼠Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.3 截短糖蛋白 具有高度免疫原性的HSV-gD-DNA疫苗已經(jīng)成功構(gòu)建，并且形成了有效的免疫保護作用，但其臨床試驗卻不足以抵御HSV感染而宣告失敗。分析其原因可能是由于gD基因較大(共1 182 bp，編碼393個aa)，將其融合到真核表達載體，在體內(nèi)表達的過程中可能會失去某些抗原表位。為增強HSV疫苗的抗原性，學(xué)者們試著去除部分功能性的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的編碼基因，同時，在不改變其編碼蛋白免疫原性的基礎(chǔ)上，盡量對其胞外區(qū)進行截短。特別是在目前尚未徹底明確完整抗原蛋白是否對宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對抗原進行截短尤為重要。

馮非等〔6〕對完整的gB進行剪切，從HSV SM44株基因組中擴增出HSV-gBt編碼基因，其含有去除了部分N基端的信號肽序列和部分胞外區(qū)基因組序列，把該目的基因插入到真核表達載體pcDNA3中，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pcDNA3-gBt。截短的糖蛋白已被證實具有明顯的免疫效果。

2.4 模擬抗原表位 隨著噬菌體隨機肽庫展示技術(shù)的誕生，學(xué)者們開始試著模擬gD的抗原表位，并試圖將其作為新型的候選抗原。于愛蓮等〔7〕從噬菌體隨機肽庫中篩選針對HSVgD單克隆抗體的基因，在11個陽性克隆序列中，有9條含有2個同源性較高的氨基酸序列，即PYH-H和P-PLW，認(rèn)為這2個氨基酸核心骨架可能是HSVgD的模擬抗原表位。抗原表位有線型構(gòu)象和模擬表位兩種，利用針對HSV-2gD的單克隆抗體(McAb)從隨機肽庫中篩選出相應(yīng)的模擬抗原表位骨架序列。

這些模擬抗原表位不需要預(yù)先確定抗原蛋白質(zhì)的氨基酸序列〔8〕。但其免疫原性及其誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的免疫保護效應(yīng)還有待進一步驗證。若能找到基因序列短，免疫原性高的替代抗原，則可謂之找到了一個新型有效的候選抗原。將多個模擬抗原表位同時克隆在同一載體中構(gòu)建多表位復(fù)合疫苗，將為HSV-DNA疫苗提供更有效更廣闊的發(fā)展前景。

2.5 多表位復(fù)合疫苗 將多個抗原基因?qū)胪惠d體中構(gòu)建多表位復(fù)合疫苗，可大大增強疫苗的免疫原性，從而誘導(dǎo)出強大的免疫保護作用。對HSV的抗原性及抗原表位的深入研究，使多表位復(fù)合疫苗成為可能。Domingo等〔9〕對gD和gB復(fù)合疫苗的研究結(jié)果表明，gD/gB共同免疫刺激機體產(chǎn)生的保護效果要優(yōu)于單一糖蛋白免疫的效果。單一抗原表位疫苗用于防治HSV感染具有一定的局限性，多表位復(fù)合疫苗可能是最為理想的疫苗。

徐金華等〔10〕將 HSV-2疫苗的主要候選糖蛋白 gD、gB、gC和早期表達蛋白ICP27基因融合，成功構(gòu)建了HSV-2多表位復(fù)合疫苗，用其免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生HSV-2特異性IgG和IFN-γ，且CTL活性增強。

3 增強機體反應(yīng)性

3.1 接種方式 在影響DNA疫苗免疫效果的諸多因素中，接種方式起著關(guān)鍵作用。DNA疫苗通常首選肌肉注射，由于肌肉組織是分化的終末細(xì)胞，將外源DNA整合到細(xì)胞基因組DNA的可能性很小，故該途徑免疫效果不佳。HSV-DNA疫苗接種效率還有待提高。為增強疫苗的導(dǎo)入效率及其隨后誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)，學(xué)者們試圖用各種接種途徑來探究其免疫誘導(dǎo)效應(yīng)。

有科學(xué)家用HSV-2gD經(jīng)不同途徑免疫豚鼠，比較發(fā)現(xiàn)陰道內(nèi)接種對豚鼠的免疫保護作用最強〔11〕。徐金華等〔10〕研究結(jié)果表明用脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒比裸質(zhì)粒肌肉注射免疫小鼠能顯著提高其免疫活性。Jazayeri等〔12〕報道，經(jīng)足底皮下注射(pcDNA3-gD2)免疫小鼠較肌肉注射的免疫效果更好。HSV-DNA疫苗免疫接種途徑較靈活，目前尚未達到統(tǒng)一。

3.2 表達載體 DNA疫苗是病原體的保護性抗原基因和載體的重組質(zhì)粒。HSV-DNA疫苗的研究不斷有新突破，國內(nèi)外學(xué)者也分別成功構(gòu)建了不同表達載體的重組質(zhì)粒。PcDNA3.1具有真核啟動子pcmv，能夠高水平表達下游蛋白，是構(gòu)建DNA疫苗常用的表達載體。在此基礎(chǔ)上，Invitrogen公司成功研制了真核表達質(zhì)粒pVAX1。不僅能高水平表達目的基因，同時還含有卡那霉素抗性基因的特性，目前已經(jīng)廣泛用于DNA疫苗研制。但目前為止世界上仍沒有一種合適于人用的HSV-DNA疫苗，因為目前構(gòu)建DNA疫苗的載體質(zhì)粒通常含有氨芐青霉素抗性基因，其副作用較大，不符合人用DNA疫苗載體的安全標(biāo)準(zhǔn)。何方等〔13〕已成功去除了真核表達質(zhì)粒載體pcDNA3中的氨芐青霉素抗性基因，構(gòu)建了含Kan抗性的真核表達質(zhì)粒載體pcDNAKan，為新型HSV-DNA疫苗的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

3.3 聯(lián)合免疫 國內(nèi)外學(xué)者正在探索新的DNA疫苗方法，如DNA疫苗聯(lián)合免疫，核酸/蛋白的聯(lián)合免疫等。Fotouhi等〔14〕用pcDNA3-gD2免疫小鼠，再有g(shù)D2蛋白加強免疫一次，結(jié)果顯示聯(lián)合免疫效果比單獨用DNA疫苗或蛋白疫苗免疫兩次要顯著增強。

安全性分析將外源性抗原重組質(zhì)粒DNA整合到宿主細(xì)胞DNA中，首先要考慮的一個重要問題是安全性。于芳等〔15〕用不同劑量pcDNA3-gB(100，300，500 mg/L)免疫小鼠后，分別檢測各組小鼠的血液生理學(xué)，血液生化學(xué)指標(biāo)以及8個重要組織器官的病理學(xué)(心、肝、脾、肺、腎、角膜、腦和三叉神經(jīng)節(jié))，結(jié)果各項指標(biāo)均無明顯變化，與對照組(生理鹽水組)相比無顯著性差異，初步說明pcDNA3-Gb是安全的。

4 展望

HSV感染激發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答傾斜漂移于Th2介導(dǎo)的體液免疫，即發(fā)生了免疫逃避，使得HSV病毒不能有效清除，從而潛伏于神經(jīng)節(jié)。Th1/Th2平衡失調(diào)越嚴(yán)重，GH患者復(fù)發(fā)就越頻繁。因此能否有效誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答是評價HSV-DNA疫苗效果的重要指標(biāo)。優(yōu)化HSV-DNA疫苗的最終目標(biāo)是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的Th1型細(xì)胞免疫，同時應(yīng)增加T細(xì)胞庫中特異性CTL細(xì)胞的數(shù)量。多表位復(fù)合DNA疫苗有很好的應(yīng)用前景。無論是DNA疫苗本身還是免疫佐劑，其免疫效應(yīng)都隨著免疫途徑和劑量的不同而不同，這些將有待進一步研究和改進。一旦明確其影響效應(yīng)，將有助于DNA疫苗的優(yōu)化，增強其實用性。同時也要考慮HSV-DNA疫苗是否存在免疫耐受、基因突變、非目的基因編碼蛋白的副作用。

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R373

A

1005-9202(2012)06-1317-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.06.109

廣西自然科學(xué)基金(2010GXNSFA013249)

程培華(1959-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事皮膚病毒性及真菌性疾病研究。

夏 利(1986-)，女，碩士，主要從事皮膚病毒性及真菌性疾病研究。

〔2011-03-30收稿 2011-09-21修回〕

(編輯 張 慧)