侯曉暉，孫廷，李曉飛

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000)

九香蟲Aspongopus chinensisDallas，隸屬于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae，俗稱黑兜蟲、打屁蟲、屁板蟲、屁巴蟲等，分布于我國(guó)云南、貴州、四川等省，為我國(guó)特有種［1］，是一種重要的中藥昆蟲?！侗静菥V目》早有記載:“咸，溫，無(wú)毒，用于膈脘滯氣、脾腎虧損、壯腎之陽(yáng)”［2］。近年有報(bào)道稱，九香蟲是一種抗癌昆蟲，主治食管癌、胃癌［3-4］，但缺乏藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。

本研究通過三氯甲烷冷浸法提取九香蟲體內(nèi)的有效成分進(jìn)行體外抗人胃癌SGC-7901和肝癌HepG2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，并初步推測(cè)抗癌活性成分在九香蟲體內(nèi)的存在形式，從而為其藥用價(jià)值的深入開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料和儀器

1.1 九香蟲標(biāo)本采自貴州省遵義市習(xí)水縣土城鎮(zhèn)赤水河邊，將標(biāo)本置于烘箱中干燥后保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)前將其研磨成粉末。

1.2 細(xì)胞株胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和肝癌細(xì)胞株HepG2，均由遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試劑RPMI 1640培養(yǎng)液(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司)、細(xì)胞周期與凋亡試劑盒(杭州碧云天生物技術(shù)有限公司)、胰酶(Solarbio)、二甲基亞楓(DMSO，Solarbio)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbio)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB公司);倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司);臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司);臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 三氯甲烷浸提物制備取九香蟲粉末10 g，用60 mL三氯甲烷浸泡12 d，過濾、自然揮干，得到九香蟲的粗提物浸膏。取此浸膏0.5 g，溶于0.5 mL的三氯甲烷中，充分溶解后過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代將SGC-7901和HepG2細(xì)胞置于37℃、飽和相對(duì)濕度5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清及1%抗生素(青霉素100 mg/L和鏈霉素100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)并鋪滿瓶底時(shí)，采用0.25%的胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，將其接種于96孔板中待用［5］。實(shí)驗(yàn)設(shè)置給藥組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，其中空白對(duì)照組為僅加入培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組為加入含三氯甲烷的培養(yǎng)基，而給藥組為加入九香蟲三氯甲烷浸提物，設(shè)置6個(gè)不同濃度，并設(shè)6個(gè)重復(fù)(見表1)。按照實(shí)驗(yàn)需要加入100 μL含/不含藥培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(OD)值，并用下式計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及其IC［6］50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次:

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=［1－D(K)給藥組/D(K)對(duì)照組］×100%

IC50=Ig－1［Xm－I(∑p－0.5)］［D(K)代表OD值，K是變量，Xm為最大劑量對(duì)數(shù)值，P為細(xì)胞抑制率，∑p各組細(xì)胞抑制總和，I為相鄰兩組劑量比值的對(duì)數(shù)］。

2.4 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901和HepG2細(xì)胞用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞爬片生長(zhǎng)。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞在蓋玻片上貼壁良好后，加入三氯甲烷浸提物處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期收集給藥組(2 000 μg/mL和1 000 μg/mL)和空白對(duì)照組細(xì)胞于離心管中，離心收集細(xì)胞;PBS洗滌，加入70%乙醇，置于4℃冰箱中固定36 h以上。收集細(xì)胞，PBS再次洗滌;避光條件下加入200 μL染色液(含RNase A的碘化丙啶染色液PI)，輕輕吹打均勻，溫?zé)?0 min后，4℃放置備用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，結(jié)果用CELLQuest軟件分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差即(±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化九香蟲三氯甲烷浸提物(500 μg/mL)處理SGC-7901和HepG2細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比細(xì)胞數(shù)目明顯減少。鏡下可見空白對(duì)照組的細(xì)胞成群貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞透亮、胞膜清晰、折光性好;而給藥組貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞變圓，皺縮，與鄰近細(xì)胞之間空隙加大，形成較多的細(xì)胞碎片(見圖1)。

圖1 九香蟲三氯甲烷浸提物對(duì)SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effects of the crude extracts on the morphous of SGC7901 cells

3.2 三氯甲烷浸提物對(duì)SGC-7901和HepG2細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三氯甲烷浸提物對(duì)SGC-7901和HepG2細(xì)胞具有明顯的體外增殖抑制作用，并呈劑量依賴性(見表1、圖2)。由上述IC50計(jì)算公式可知，三氯甲烷浸提物對(duì)兩種癌細(xì)胞的IC50分別為1 193.52 μg/mL和964.34 μg/mL。

表1 九香蟲三氯甲烷浸提物對(duì)SGC-7901和HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=6)Tab.1 Effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells(±s，n=6)

表1 九香蟲三氯甲烷浸提物對(duì)SGC-7901和HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=6)Tab.1 Effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells(±s，n=6)

三氯甲烷浸提物/(μg·mL－1)SGC-7901抑制率/%HepG2抑制率/%125 14.13±0.033 4 18.89±0.018 4 250 29.93±0.025 5 54.05±0.026 8 500 33.94±0.038 7 62.89±0.012 7 1 000 38.78±0.010 6 71.20±0.029 5 2 000 45.49±0.038 0 75.04±0.026 9 4 000 91.57±0.007 2 78.33±0.021 2

圖2 九香蟲三氯甲烷浸提物對(duì)SGC-7901和HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of crude extracts on the proliferation of SGC-7901 and HepG2 cells

3.3 三氯甲烷浸提物對(duì)SGC-7901和HepG2細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，三氯甲烷浸提物的中劑量組(2 000 μg/mL)和高劑量組(4 000 μg/mL)處理細(xì)胞24 h后與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞周期中各時(shí)相細(xì)胞數(shù)發(fā)生顯著變化，而SGC-7901細(xì)胞周期的分布變化規(guī)律不明顯(見圖3、表2)。

HepG2細(xì)胞對(duì)照組G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例分別為57.66%、34.71%和7.63%;而中劑量組細(xì)胞比例分別為69.65%、24.92%和5.43%，高劑量組細(xì)胞比例分別為76.99%、16.91%和6.10%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，給藥組的S期細(xì)胞比例明顯降低、G2/M期細(xì)胞變化不大，而G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)。

4 討論

近年來(lái)，惡性腫瘤已逐步上升為第一大殺手，而胃癌和肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，臨床主要以手術(shù)治療合并術(shù)后放療和化療為主要治療手段，但對(duì)晚期效果不佳。臨床上不斷探索新的抗癌藥物的開發(fā)與應(yīng)用，而九香蟲作為我國(guó)特有的中藥昆蟲，

圖3 九香蟲三氯甲烷浸提物對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of the crude extracts on cell cycle of HepG2

表2 HepG2和SGC7901細(xì)胞周期各時(shí)相分布結(jié)果Tab.2 Results of DNA analysis on HepG2 and SGC7901 cells

有報(bào)道稱其對(duì)食管癌、胃癌等有一定療效［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，九香蟲三氯甲烷浸提物通過對(duì)細(xì)胞周期的影響，可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，且這一變化呈現(xiàn)劑量依賴性。盡管本研究中IC50較大，但究其原因應(yīng)為本實(shí)驗(yàn)中使用的是九香蟲的三氯甲烷浸提物而非純品［7-8］。

腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)是細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡失調(diào)，由于細(xì)胞紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期機(jī)制的破壞是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，細(xì)胞一旦從G1期跨入S期，則可以不再依賴外界信息刺激而很快自動(dòng)完成分裂過程［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞在藥物作用后呈現(xiàn)G0/G1期的阻滯現(xiàn)象，這可能阻斷了細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂，從而延長(zhǎng)了細(xì)胞周期，這與植酸等阻滯HepG2細(xì)胞于G1期從而抑制細(xì)胞增殖相類似［10-11］。但是，其確切的分子機(jī)制將有待于進(jìn)一步深入研究和探討。

九香蟲的三氯甲烷浸提物對(duì)兩種癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，由于三氯甲烷可提取九香蟲體內(nèi)的非極性成分(即脂類物質(zhì))，故可初步推斷其抗腫瘤活性成分為此類物質(zhì)，但由于此三氯甲烷浸提物成分復(fù)雜且純度較低，故尚不能確定其為何種物質(zhì)(即單一純品)［12］。

迄今為止，人們對(duì)九香蟲藥用機(jī)理的研究少之又少，本實(shí)驗(yàn)正是根據(jù)傳統(tǒng)中藥藥用價(jià)值的研究方法而展開研究，希望能為這一重要的中藥昆蟲——九香蟲在臨床防治腫瘤方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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