孔慧，郝麗靜，邢紅霞，吳黃焱，倪健*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102;2.河北大學(xué)，河北保定071000;3.曲阜市中醫(yī)醫(yī)院，山東曲阜273100)

寧心解郁膠囊為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院主持研發(fā)的中藥第五類新藥，由萱草花(百合科植物萱草Heirieroe-allis fulvaL.或黃花菜Hemerocallis citriaBaroni的干燥花蕾)提取精制而成，具有寧心解郁［1］的功效，主要用于治療抑郁癥。據(jù)報(bào)道萱草花化學(xué)成分復(fù)雜［2-3］，主要含黃酮類成分［4-6］，本試驗(yàn)對(duì)制劑中的萱草花進(jìn)行了薄層色譜鑒別［7］;定量測定研究用紫外分光光度法［8-9］測定制劑中總黃酮，用HPLC法［10］測定制劑中蘆丁，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器TU—1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);SD—20島津液相色譜儀(日本)，四元泵(LC—20ATvp)，SPD—M20A二極管陣列檢測器，LC—液相色譜工作站。Sartorius電子分析天平(BT 125D)。KQ3200DE型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料寧心解郁膠囊樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)制備;蘆丁對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院(100080-200707)。甲醇為色譜純(Fisher公司);水為屈臣氏純凈水;其他試劑均為分析純。

2 鑒別

萱草花的鑒別取本品膠囊內(nèi)容物約0.5 g，用適量30%乙醇超聲溶解，離心取上清液，作為供試品溶液。另取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作為蘆丁對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺板上，以甲醇-水(1∶1)為展開劑，展開，取出，噴1%三氯化鋁展開劑顯色，置紫外光燈(365 nm)下檢視。檢測色譜中，供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 萱草花的鑒別圖譜

3 定量測定［11-13］

3.1 紫外分光光度法測定總黃酮

3.1.1 測定波長的選擇蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和萱草花提取液分別按實(shí)驗(yàn)方法顯色后，在波長400～600 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后在510 nm處有最大吸收，萱草花提取液顯色后在此波長下也有吸收，實(shí)驗(yàn)選用510 nm為測定波長。

3.1.2 供試品溶液的制備精密稱取本品粉末20 mg，置10 mL量瓶中，加30%乙醇至刻度，超聲處理10 min，即得。

3.1.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，搖勻，即得。

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參照郝麗靜等［14］在測定萱草花總黃酮時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行制備。

3.1.5 測定方法取供試品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，測定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中含蘆丁的質(zhì)量濃度，即得。

3.1.6 方法學(xué)考察結(jié)果穩(wěn)定性試驗(yàn):結(jié)果顯示樣品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD值＜2.0%。精密度試驗(yàn)(n=6)、重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)和加樣回收率試驗(yàn)(n=6)的結(jié)果顯示:RSD值均＜2.0%，符合方法學(xué)考察的要求，加樣回收率平均值為101.28%，在95%～105%之間，符合要求。

3.2 HPLC法測定蘆丁

3.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-0.5%冰醋酸溶液(40∶60)為流動(dòng)相;檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

3.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，搖勻，即得。

3.2.3 供試品溶液的制備精密稱取本品粉末20 mg，置10 mL量瓶中，加30%乙醇至刻度，超聲10 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.4 測定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，既得。

3.2.5 專屬性試驗(yàn)取制劑輔料糊精10 mg，置10 mL量瓶中，加30%乙醇至刻度，超聲10 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得陰性樣品溶液。進(jìn)樣10 μL，按以上色譜條件測定，結(jié)果無干擾峰出現(xiàn)。見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

3.2.6 線性關(guān)系的考察精密吸取質(zhì)量濃度為0.383 0 mg/mL的蘆丁對(duì)照品0、1、3、5、7、9、11 μL，分別注入高效液相色譜儀，測得峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。回歸方程為Y=2×106X－34 857，r=1。結(jié)果表明蘆丁進(jìn)樣量在0～4.213 0 μg與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

3.2.7 精密度試驗(yàn)取樣品溶液10 μL，按以上色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD為0.74%。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔2 h進(jìn)樣1針，結(jié)果顯示，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。RSD值為0.32%。

3.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)按樣品定量測定項(xiàng)下的方法對(duì)批號(hào)20110530的樣品進(jìn)行測定，共測定6份，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.60%，RSD值為1.64%。

3.2.10 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取樣品(批號(hào)20110530，蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.60%)10 mg，共測定6份，置10 mL量瓶中，加入0.383 0 mg/m L的蘆丁對(duì)照品溶液4 mL，按樣品方法制備供試品溶液，測定含有量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

3.3 樣品測定精密稱取3批樣品，分別按供試品溶液的制備方法制備，分別按以上紫外分光光度法和高效液相色譜法測定，分別代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果

4 討論

4.1 HPLC測定波長的選擇分別取蘆丁對(duì)照品和樣品溶液進(jìn)液相，DAD檢測器檢測，蘆丁的光譜圖顯示在254 nm和365 nm有兩個(gè)大的吸收峰，但是樣品在254 nm檢測出的峰個(gè)數(shù)較多，故選擇254 nm作為測定波長。

4.2 色譜柱的選擇采用Agilent ZORBAX SB-C18，Diamonsil ODS-C18色譜柱(均為416 mm×250 mm，5 μm)2種色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行測定，流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰醋酸水(40∶60)。結(jié)果不同廠家色譜柱對(duì)測定結(jié)果影響不大。

［1］賀弋，韓珍，楊俊，等.萱草花抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30(8):682-683.

［2］Que Fei，Mao Linchun，Zheng Xiaojie.In vitro and vivo antioxidant activities of daylily flowers and the involvement of phenolic compounds［J］.Asia Pac J Clin Nutr，2007，16(Suppl 1):196-203.

［3］Tai C Y，Chen B H.Analysis and stability of carotenoids in the flowers of daylily(Hemerocallis disticha)as affected by various treatments［J］.J Agric Food Chem，2000，48(12):5962-5968.

［4］傅茂潤，茅林春.黃花菜的保健功效及化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(10):108-112.

［5］康曉燕.黃花菜的理化指標(biāo)測定［J］.宜賓學(xué)院學(xué)報(bào)，2005(12):67-68.

［6］滕坤，邵麗娜，李娜.黃花菜中總黃酮的提取工藝研究［J］.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(4):33-34.

［7］張冬冬，王春艷，解春華.薄層層析法測定黃花菜中黃酮成份［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2002，12(4):445.

［8］滕坤，郭輝.運(yùn)用分光光度法測定黃花菜中總黃酮的含量［J］.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(2):50-51.

［9］趙二勞，段晉峰.分光光度法測定黃花菜中總黃酮［J］.分析試驗(yàn)室，2008，27(9):94-96.

［10］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:333.

［11］吳金偉，何宇新，陳慧娟.冠脈通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，2010，32(8):1446-1448.

［12］胡太德，陳紹成.通便靈膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中成藥，2008，30(8):1159-1161.

［13］何承輝，邢建國，王新春，等.維藥香青蘭滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中成藥，2011，33(2):272-276.

［14］郝麗靜，郝斌，趙青，等.萱草花總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(6):1643-1645.