閔鶴鳴， 魯璐清， 王文娟， 武曉寧， 閔連秋

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)損傷是一種重要的由于供血障礙引起的應(yīng)激性疾病［1］，血供中斷后一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)，可引起缺血組織發(fā)生較血供恢復(fù)前更嚴(yán)重的損傷。有研究證明腦缺血/再灌注后存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，且與神經(jīng)元凋亡有關(guān)［2，3］。caspase 家族是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，其中caspase-9為凋亡啟動(dòng)酶，caspase-3為凋亡效應(yīng)酶。2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose，2-DG)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護(hù)性蛋白GRP78的誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)ERS的發(fā)生。本研究從ERS的角度探討腦缺血預(yù)處理在缺血/再灌注大鼠腦損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物與分組 健康雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體重280～320g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(遼)2003-0007。隨機(jī)分為腦缺血預(yù)處理組:缺血預(yù)處理30min，再灌注3d，再次缺血2h，再灌注24h處死大鼠;2-DG預(yù)處理組:2-DG溶于雙蒸水，工作濃度為50mg/ml，按照100mg·kg-1·d-1的劑量給予大鼠腹腔注射，每天一次，連續(xù)7d后進(jìn)行假手術(shù)處理，再灌注3d，缺血2h，再灌注24h處死大鼠;腦缺血/再灌注組:假手術(shù)處理，再灌注3d，缺血2h，再灌注24h處死大鼠;對(duì)照組:第一次假手術(shù)后再灌注3d，第2次假手術(shù)后再灌注24h處死大鼠。每組12只。

模型制備:參照 Longa［4］和 Nagasawa［5］報(bào)道的方法加以改進(jìn)制備大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛350mg·kg-1腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和ICA的顱外分支-翼腭動(dòng)脈。將ICA遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾夾閉，距CCA分叉處近心端0．5cm處將CCA剪一小口，插入碳素魚線，松開動(dòng)脈夾，向ICA插入魚線(20±2)mm，直至稍感阻力，栓線進(jìn)入ICA后，穿過MCA起始端至大腦前動(dòng)脈近端，阻斷MCA的所有血流來源，扎緊備線，外留10mm線頭。30min后輕輕提拉所留線頭，拔出5mm，使血流再通，形成再灌注，將栓線尾部埋在皮下，縫合切口，再灌注3d后用相同方法進(jìn)行缺血及再灌注。模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠清醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征及對(duì)側(cè)以前肢為主的癱瘓，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在1～3分［4］。假手術(shù)為僅暴露CCA、ECA及ICA，栓線插入CCA及ICA但不阻斷MCA，術(shù)前禁食12h，術(shù)中及術(shù)后維持體溫在37℃左右，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

1．2 藥品和試劑 GRP78、CHOP和 caspase-9多克隆一抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;caspase-3多克隆一抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;2-DG購于天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;免疫組化試劑盒和顯色試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由南京凱基生物發(fā)展有限公司提供。

1．3 檢測(cè)指標(biāo)

1．3．1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 采用 Z ea Longa［4］6級(jí)5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。

1．3．2 腦梗死體積測(cè)定 進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后將大鼠斷頭處死，迅速取出左腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，于－20℃冰箱中速凍2min，將大腦作連續(xù)2mm冠狀切片，共6片，然后將腦片放入2%TTC磷酸鹽緩沖液中37℃恒溫孵育1h，正常腦組織染為紅色，梗死灶呈白色。數(shù)碼相機(jī)拍照后，應(yīng)用病理圖像分析儀測(cè)量腦梗死面積。根據(jù)公式V=(A1+---+An)t/2算出梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積［6］。

1．3．3 腦含水量的測(cè)定 采用干、濕重法，動(dòng)物在規(guī)定時(shí)相點(diǎn)處死，斷頭取腦，分別取兩側(cè)大腦半球腦組織標(biāo)本，先用電子天平稱取濕重，然后將標(biāo)本置于95℃ ～100℃紅外線干燥箱內(nèi)烘干24～48h至恒重，稱取干重。腦含水量用濕重的百分比表示，即腦含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

1．3．4 免疫組化檢測(cè)缺血區(qū)腦組織 G RP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá) 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水室溫處理10min，微波加熱抗原修復(fù)，自然冷卻至50℃，去除過氧化物酶，去除背景染色，加 GRP78、CHOP、caspase-3 和caspase-9一抗，4℃過夜;加生物素化地高辛抗體，置于恒溫箱中 3 0min，加 S ABC，37℃，40min，DAB 顯色，顯微鏡下控制時(shí)間;蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的變化 與對(duì)照組相比，其余3組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低，差異具有顯著性(P＜0．01);而腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組之間的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分無顯著性差異(P＞0．05)(見表1)。

2．2 各組大鼠腦梗死體積的變化 與對(duì)照組相比，其余3組大鼠腦梗死體積差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組的腦梗死體積明顯縮小，差異具有顯著性(P＜0．01);而腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組之間的腦梗死體積變化無顯著性差異(P＞0．05)(見表1)。

2．3 各組大鼠腦含水量的變化 與對(duì)照組相比，其余3組大鼠腦含水量差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組的腦含水量明顯降低，差異具有顯著性(P＜0．01);而腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組之間的腦含水量無顯著性差異(P＞0．05)(見表1)。

2．4 免疫組化檢測(cè)大鼠腦組織GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá) 光學(xué)顯微鏡下觀察，GRP78陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，染色位于胞漿，細(xì)胞形態(tài)大部分正常，形態(tài)相對(duì)飽滿，呈圓形或橢圓形。對(duì)照組的GRP78陽性染色細(xì)胞表達(dá)不明顯;與對(duì)照組相比，其余3組的GRP78陽性染色細(xì)胞表達(dá)明顯增加，差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組的GRP78陽性染色細(xì)胞表達(dá)明顯增加，差異非常顯著(P＜0．01);而腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組之間的GRP78陽性染色細(xì)胞表達(dá)無顯著性差異(P＞0．05)。CHOP陽性染色細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色淡染，細(xì)胞核也呈現(xiàn)棕色，多數(shù)細(xì)胞核發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，胞核皺縮，呈梭形或條索狀;caspase-3陽性染色細(xì)胞為胞核染色呈棕黃色，可見細(xì)胞皺縮、變形，體積變小;caspase-9陽性染色細(xì)胞呈棕黃色，胞漿胞核均有表達(dá)，但以胞核表達(dá)為主，部分細(xì)胞可見細(xì)胞壞死的形態(tài)改變及染色質(zhì)濃縮。對(duì)照組的 CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細(xì)胞僅有微量表達(dá);與對(duì)照組相比，其余 3組的 CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細(xì)胞表達(dá)明顯增加，差異非常顯著(P＜0．01);與腦缺血/再灌注組比較，腦缺血預(yù)處理組和 2-DG預(yù)處理組的 CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細(xì)胞表達(dá)減少，差異非常顯著(P＜0．01);而腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組之間的CHOP、caspase-3和caspase-9陽性染色細(xì)胞表達(dá)無顯著性差異(P＞0．05)(見表2)。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積和腦含水量的變化(χ ± s ，n=6)

表2 各組大鼠GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)(±s，n=6)

表2 各組大鼠GRP78、CHOP、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)(±s，n=6)

與對(duì)照組相比△P＜0．01;與腦缺血再灌注組相比*P＜0．01

組別GRP78 CHOP caspase-3 caspase-9對(duì)照組腦缺血/再灌注組腦缺血預(yù)處理組2-DG預(yù)處理組35．77 ±0．49 114．89 ±0．67△155．54 ±0．83△＊156．08 ±0．89△＊5．39 ±0．37 85．163．20△71．201．87△＊70．502．18△＊161．89 ±1．44 231．28 ±2．19△208．54 ±1．56△＊207．42 ±1．42△＊172．47 ±2．09 295．37 ±3．17△256．45 ±2．47△＊254．52 ±2．63△△＊＊

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾、折疊、寡聚化而形成正確構(gòu)象及分泌的場(chǎng)所，還參與脂質(zhì)代謝和類固醇激素的合成、鈣的儲(chǔ)存等。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實(shí)現(xiàn)其功能的基本條件，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有極強(qiáng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系。盡管如此，仍有很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)ERS。缺血/再灌注時(shí)缺氧、酸中毒、ATP耗竭、鈣超載及大量自由基生成等均可作為誘導(dǎo)ERS的刺激因素，ERS在缺血/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義［7］。

GRP78和CHOP是ERS的2個(gè)經(jīng)典標(biāo)志物［8］。GRP78在ERS時(shí)表達(dá)上調(diào)，是ERS的標(biāo)志性蛋白和保護(hù)性因子，可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾，具有在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的作用［8～10］。GRP78 還具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的作用［11］。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)促凋亡蛋白，在正常細(xì)胞中表達(dá)很低，但是在ERS時(shí)下被大量誘導(dǎo)表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡途徑［12，13］。

腦缺血預(yù)處理是指對(duì)腦預(yù)先進(jìn)行短暫的、一次或多次亞致死性缺血預(yù)處理，可以減輕24h后發(fā)生的致死性腦缺血再灌注所造成的損傷，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，30min局灶性腦缺血預(yù)處理再灌注后，可以明顯降低大鼠缺血2h后再灌注24h的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、縮小腦梗死灶體積和降低腦組織含水量;與腦缺血/再灌注組相比，預(yù)處理缺血組GRP78的蛋白表達(dá)明顯增加，CHOP的蛋白表達(dá)明顯減少，與2-DG預(yù)處理組相似，推測(cè)腦缺血預(yù)處理可能觸發(fā)了體內(nèi)的ERS過程，對(duì)隨后而發(fā)生缺血/再灌注所造成損傷的具有神經(jīng)保護(hù)作用。

caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，細(xì)胞凋亡的最后實(shí)施是通過caspase的激活而實(shí)現(xiàn)的［14］。ERS 時(shí) caspase 被特異性激活［15］，其激活過程表現(xiàn)為級(jí)聯(lián)反應(yīng):即先激活凋亡始動(dòng)子caspase-9，再激活凋亡效應(yīng)子caspase-3，作用于特異性的底物引起細(xì)胞的凋亡。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，腦缺血再灌注組、腦缺血預(yù)處理組和2-DG預(yù)處理組的caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)量明顯增加，表明腦缺血/再灌注損傷能引起 caspase-3和caspase-9蛋白的活化，啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡途徑以caspase-3和caspase-9表達(dá)上調(diào)為主，提示caspase-3和caspase-9的激活在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，并可能與細(xì)胞凋亡有關(guān);而腦預(yù)處理缺血組和2-DG預(yù)處理組caspase-3和caspase-9的表達(dá)量明顯少于腦缺血/再灌注組，進(jìn)一步提示腦預(yù)處理缺血通過抑制caspase-3和caspase-9的激活，減輕了神經(jīng)元的凋亡，對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。

［1］吳小瑋，何婭妮．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腎臟疾?。跩］．腎臟病與透析腎移植雜志，2007，16(4):364 －368．

［2］Shibata M，Hattori H，Sasaki T，et al．Activation of caspase-12 by endoplasmic reticulum stress induced by transient middle cerebral artery occlusion in mice［J］．Neuroscience，2003，118(2):491 －499．

［3］Paschen W，Aufenberg C，Hotop S，et al．Transient cerebral ischemia activates Processing of xbp1 messenger RNA indicative of endoplasmic reticulum stress［J］．Cereb Blood Flow Metab，2003，23(4):449 －461．

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlotn S，et al．Reversible middle cerebral artery oclusion without craniotomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84－91．

［5］Nagasawa H，Kogure K．Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］．Stroke，1989，20(8):1037 － 1043．

［6］Kitagawa H，Hayashi T，Mitsummoto Y．Reduction of ischemic brain injury by topical application of glial cell line-derived neurotrophic factor after permanent middle cerebral artery occlusion in rats［J］．Stroke，1998，29(7):1417 －1422．

［7］祝筱梅，劉秀華．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與缺血再灌注損傷及其防護(hù)［J］．國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2006，26(2):177－180．

［8］Yoshida H，Haze K，Yanagi H，et al．Identification of the cis-acting endoplasmic reticulum stress response element responsible for transcriptional induction of mammalian glucose-regulated proteins involvement of basic leucine zipper transcription factors［J］．J Biol Chem，1998，273(50):33－41．

［9］Lee E，Nichols P，Spicer D，et al．GRP78 as a novel predictor of responsiveness to chemo therapy in breast cancer［J］．Cancer Res，2006，66(16):7849 －7853．

［10］Oida Y，Izuta H，Oyagi A，et al．Induction of BiP，an ER-resident protein，prevents the neuronal death induced by transient forebrain ischemia in gerbil［J］．Brain Res，2008，1208:217 － 224．

［11］Verkhratsky A．Endoplasmic reticulum calcium signaling in nerve cells［J］．Biol Res，2004，37(4):693 －699．

［12］Zinszner H．CHOP is implicated in programmed cell death in response to impaired function of the endoplasmic reticulum［J］．Genes Dev，1998，12(7):982 －995．

［13］Mccullough KD，Martindale JL，Klotz LO，et al．GADD153 sensitizes cells to endoplasmic reticulum stress by down-regulating Bcl-2 and perturbing the cellular redoxstate［J］．Mol Cell Biol，2001，21(4):1249－1259．

［14］Bratton SB，MacFarlane M，Cain K，et al．Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis［J］．Exp Cell Res，2000，256(1):27 － 33．

［15］Nakagawa T，Zhu H，Morishima N，et al．caspase-12 mediates endoplasmic reticulum specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta［J］．Nature，2000，403:98 － 103．