孫錦秀
桑黃(Phellinus vaninii Ljub)屬擔子菌亞門(Basidiomcota),層菌綱(Hymenomycetes),多孔菌科(Polyporaceae),木層孔菌屬(Phellinus)[1]。最新研究表明,桑黃具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成活性等多種藥理作用[2-4],主要含有可溶性多糖、三萜和黃酮等活性成分[5],是少有的含有活性黃酮化合物的藥用真菌。桑黃總黃酮成分是其抗氧自由基的主要活性部位[6],目前對桑黃總黃酮分離純化的系統(tǒng)研究很少。本文應用大孔樹脂對桑黃總黃酮進行純化富集,優(yōu)選最佳工藝條件。
1.1 主要儀器 KQ-250B超聲波清洗儀(昆山市聲儀器有限公司),R2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi公司),UV-2401紫外可見分光光度計(日本島津公司),D100B恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)。
1.2 試藥 桑黃(楊樹桑黃),延吉市長白山特產(chǎn)經(jīng)營部;蘆丁對照品(含量≥98%),南京澤朗植提有限公司,批號:ZL20111108;AB-8大孔吸附樹脂(含酯基的苯乙烯聚合物,非極性)、D101大孔吸附樹脂(苯乙烯聚合物,非極性)、NKA-9大孔吸附樹脂(苯乙烯聚合物,極性),天津南開和成化工有限公司。
2.1 桑黃總黃酮粗提物的制備 準確稱取15 g桑黃子實體粉末(過60目篩),置燒瓶中,加70%乙醇450 mL,室溫下浸泡 12 h后,超聲提取30 min,抽濾,殘渣再超聲提取1次,合并2次濾液,濃縮烘干,得到桑黃醇提物粗品。
2.2 含量測定
2.2.1 溶液配制 對照液:準確稱取蘆丁對照品25 mg,70%乙醇溶解定容至50 mL;AlCl3液:含水AlCl31.8 g,70%乙醇溶液定容至100 mL;樣品液:準確稱取桑黃醇提物17.3 mg,70%乙醇定容至25 mL。
2.2.2 標準曲線 精密吸取對照液0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL,置50 mL量瓶,分別加AlCl3液4.0 mL和去離子水15 mL,70%乙醇定容,30℃水浴10 min,室溫放置20 min后,408 nm處測吸光度。得線性回歸方程:A=0.026 3 C+0.009 7 (r=0.999 8),蘆丁濃度在8~40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。
2.2.3 樣品總黃酮含量測定 精密吸取樣品液1.5 mL,同“2.2.2”項下操作,桑黃粗提物中總黃酮含量為464.5 mg/g。
2.3 純化工藝考察
2.3.1 樹脂預處理 取一定量樹脂,95%乙醇溶劑浸泡24 h,濕法裝柱,95%乙醇洗脫,控制流速,洗至流出液與水1∶2混合不產(chǎn)生渾濁后,水洗至無醇味,3柱體積(BV)的3%鹽酸溶液浸泡3 h,用水洗至中性,再用3 BV的3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h,水洗至中性。
2.3.2 樹脂的選擇 精密稱取 D101、AB-8、NKA-9樹脂各5.0 g,置于50 mL具塞錐形瓶中,加入總黃酮含量為2.064 mg/mL的桑黃粗提物溶液(C0)45 mL,置搖床室溫下振搖24 h,取上清液,測其總黃酮含量(C1)。取出吸附飽和的樹脂,吸干表面水分,加70%乙醇45 mL,室溫下振搖24 h,再取上清液,測其總黃酮含量(C2)。以飽和吸附量和解吸率為考察指標,觀察各樹脂的吸附性能。飽和吸附量Q=(C0-C1)×V/W,W為樹脂質(zhì)量(g);解吸率(%)=C2/(C0-C1)×100%。結(jié)果見表1,選擇AB-8為桑黃粗提物的純化樹脂。
表1 三種大孔樹脂的吸附性能比較
2.3.3 pH值對吸附的影響 取5.0 g預處理的AB-8大孔樹脂置于 50 mL具塞錐形瓶中,加2.064 mg/mL桑黃粗提物溶液45 mL,用鹽酸或者NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值分別為4、5、6、7、9。室溫下振蕩24 h。取上清液測定總黃酮含量,計算室溫下的樹脂靜態(tài)吸附量。見圖1。
圖1 pH值對樹脂飽和吸附率量的影響
由圖1可見,pH為5時,樹脂靜態(tài)飽和吸附量最大,可能由于桑黃中的黃酮類化合物為多羥基酚類,呈弱酸性,在酸性條件下呈分子狀態(tài),以氫鍵方式被吸附,酸性過強,黃酮類化合物易生成烊鹽,使吸附效果變差;堿性增大則使酚羥基上的氫解離形成酸根離子,樹脂的結(jié)合減弱,從而使吸附量降低。桑黃醇提物溶液pH值介于5和6之間,因此,本實驗不另加緩沖鹽。
2.3.4 上樣濃度考察 稱取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g桑黃總黃酮粗提物,用70%乙醇30 mL超聲溶解,加水稀釋至100 mL作為上柱液,計算總黃酮含量(C0)。AB-8大孔樹脂50 g濕法裝柱(φ 2.4 cm,300 mm,徑高比1∶10),分別用1 BV去離子水和5 BV 70%乙醇洗脫,乙醇洗脫液濃縮后定容至100 mL,測總黃酮含量(C2),計算洗脫率,洗脫率(%)=C2/C0×100%,見圖2。
圖2 上樣濃度考察
由圖2可見,上樣濃度較小時,效率較低,由于死吸附等損耗,使洗脫率降低;當上樣濃度達到5 mg/mL(黃酮含量2.323 mg/mL)時,變化很小。濃度越大越容易出現(xiàn)沉淀,導致柱層析堵塞,使流速變慢,所以選擇上樣濃度為5 mg/mL。
2.3.5 泄露曲線 取粗提物濃度5 mg/mL上柱液上柱,每10 mL收集1個流份,于378 nm波長處測吸光度。見圖3。
圖3 AB-8大孔樹脂的動態(tài)吸附泄漏曲線
從圖3可見,上柱液量少時,流出液吸光度較小;當上柱液達到30 mL時,桑黃黃酮開始出現(xiàn)泄漏,隨著流出液體積的增加,流出液的吸光度逐漸增大。當流出液體積增至100 mL時,達到吸附平衡,流出液吸光度不再發(fā)生變化。
2.3.6 洗脫劑濃度考察 取粗提物濃度5 mg/mL上柱液100 mL上柱,1 BV去離子水洗,再分別用5 BV的30%、50%、70%、90%乙醇溶液洗脫。洗脫液濃縮干燥后稱重,測定總黃酮含量,計算得率:得率(%)=上柱的粗提物的重量/純化后的質(zhì)量。見表2。表2顯示,90%醇洗脫所得總黃酮含量高,但得率較低;70%醇洗脫黃酮含量與90%醇洗脫接近,但得率較高。綜合考慮,70%醇為最佳洗脫劑濃度。
表2 洗脫劑濃度影響
2.3.7 流速考察 取粗提物濃度5 mg/mL上柱液100 mL上柱,1 BV去離子水洗,再以5 BV 70%乙醇洗脫,恒流泵控制流速分別為1、2、3 BV/h。洗脫液濃縮干燥后稱重,計算得率。分別為73.23%、70.72%、62.18%。流速越慢洗脫越完全;過快會減少被吸附物質(zhì)和樹脂的接觸時間,進而影響吸附效果,洗脫不完全;而流速過慢,會延長生產(chǎn)周期,同時滯留在樹脂中的雜質(zhì)較多,再生困難,縮短樹脂使用壽命。綜合考慮選擇流速2 BV/h。
2.3.8 樹脂再生 AB-8大孔樹脂每使用一次后,用95%乙醇洗至無色,然后用水洗去乙醇即可使用。但多次反復使用后,樹脂顏色變深,吸附量下降,所以樹脂使用數(shù)次后必須再生:3 BV 3%鹽酸溶液浸泡3 h,用水洗至中性,再用3 BV 3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h,水洗至中性。
3.1 桑黃總黃酮提取物紫外掃描的最大吸收峰在378 nm,加 AlCl3絡(luò)合后最大吸收峰移至408 nm,提高了專屬性。
3.2 根據(jù)上述結(jié)果,大孔樹脂純化富集桑黃總黃酮的最佳工藝:AB-8大孔樹脂50 g濕法裝柱(φ 2.4 cm,300 mm,徑高比1∶10),5 mg/mL桑黃粗提物溶液100 mL上樣,1 BV水洗后以5 BV 70%乙醇洗脫,流速2 BV/h,乙醇洗脫液干燥濃縮得到精制桑黃總黃酮。
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