孟祥慧，張建波，初金玉

病理性瘢痕(包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩)是人體皮膚組織損傷后的一種纖維過(guò)度增生性疾病。在增生性瘢痕形成中，膠原代謝的失調(diào)起著重要的作用。膠原蛋白主要產(chǎn)自成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，而增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有更強(qiáng)的產(chǎn)生膠原能力［1］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor，TGF)β是一種重要的致纖維化因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，給予外源性TGF-β可促進(jìn)纖維化和瘢痕反應(yīng)，抑制TGF-β信號(hào)通路則可有效地抑制瘢痕化［2-3］?；罨厥荏w樣激酶5(Activin receptor-like kinase 5，ALK5)是TGF-β的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，對(duì)TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著關(guān)鍵作用。研究表明，抑制ALK5可降低肺臟的纖維化基因表達(dá)和膠原沉積［4］。本研究以增生性瘢痕原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察ALK5抑制劑CP-639180對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白(Collagen type I，COL1A2)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Smooth muscle actin，SMA)表達(dá)的影響，探討ALK5抑制劑在增生性瘢痕治療中的可能應(yīng)用和作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑及藥品 CP-639180(Sigma);達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco);胎牛血清(Hyclone); TRIzol(Invitrogen);PrimeScriptRT-PCR Kit (DRR037S，TaKaRa);α-SMA、COL1A2及內(nèi)參GAPDH定量PCR引物由TaKaRa公司合成(序列見(jiàn)表1);胞漿蛋白提取試劑盒(凱基生物);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG(sc2030，Santa Cruz);兔抗人α-SMA多克隆抗體(ab5694，Abcam);兔抗人 COL1A2及 β-actin多克隆抗體(sc28655和sc130656，Santa Cruz)。

1.2 組織標(biāo)本 6例增生性瘢痕組織標(biāo)本來(lái)源于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形外科，術(shù)前均取得患者同意?；颊吣挲g19～28歲，平均23歲，其中男4例，女2例，病程5個(gè)月～2年，均無(wú)系統(tǒng)性疾病和激素、其他藥物注射史。

表1 熒光定量PCR引物

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(HERUS);超聲波勻漿機(jī)(BioSpec);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf);PCR儀(Bio-Rad);熒光定量PCR儀LightCycler(Roche);酶標(biāo)測(cè)定儀(Bio-Rad);垂直平板蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad);G∶BOX系列全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Gene)。

2 方法

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 采用組織貼塊法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)［5］，無(wú)菌條件下將手術(shù)切下的瘢痕剪成小于0.5 mm3碎塊，平鋪于培養(yǎng)皿中，用DMEM(含胎牛血清)培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，3～4周后細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用第6～10代細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板，分別加入不同終濃度(1、5、10 μM)的CP-639180(DMSO溶解)以及同濃度的DMSO(對(duì)照)，孵育3 h后收集細(xì)胞凍存，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.2 熒光定量PCR 采用Trizol試劑提取成纖維細(xì)胞總RNA，分光光度法測(cè)定RNA濃度。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在LightCycler上進(jìn)行，反應(yīng)條件:94℃ 10 s，60℃20 s，40個(gè)循環(huán)后溶解曲線(xiàn)分析證實(shí)擴(kuò)增的特異性，每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。采用2-△△CT法計(jì)算靶基因mRNA經(jīng)內(nèi)參GAPDH標(biāo)化后的相對(duì)含量［6］。

2.3 Western blot 按照試劑盒說(shuō)明提取成纖維細(xì)胞胞漿蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按每孔20 μg總蛋白的濃度上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，成層膠濃度5%，分離膠濃度10%)分離蛋白，電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(4℃，200 mA，1.5 h)。轉(zhuǎn)印膜封閉后，分別與抗COL1A2抗體(1∶800)、α-SMA抗體(1∶400)和β-actin的抗體(1∶1 000)4℃雜交過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，均數(shù)比較采用one-way ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ALK5抑制劑對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞中COL1A2表達(dá)的影響 定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，不同劑量的ALK5抑制劑處理3 h后，瘢痕成纖維細(xì)胞中COL1A2的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的63.31%、32.39%和14.75%(P＜0.05，P＜0.01)，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，抑制劑處理組成纖維細(xì)胞中COL1A2蛋白含量明顯降低，且隨著抑制劑濃度的增加，COL1A2的蛋白水平逐漸降低(P均＜0.05)，見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 ALK5抑制劑處理后瘢痕成纖維細(xì)胞中COL1A2和α-SMA的mRNA相對(duì)水平(n=6)注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖2 ALK5抑制劑處理后瘢痕成纖維細(xì)胞中COL1A2和α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n=6)注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

圖3 Western blot檢測(cè)ALK5抑制劑對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞中COL1A2和α-SMA蛋白表達(dá)的影響

3.2 ALK5抑制劑對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響 采用同樣實(shí)驗(yàn)方法研究ALK5抑制劑對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響，隨著CP-639180濃度的增加，瘢痕成纖維細(xì)胞中α-SMA的mRNA表達(dá)水平逐漸降低(P均＜0.05)，見(jiàn)圖1。Western blot檢測(cè)結(jié)果與定量PCR結(jié)果相似，成纖維細(xì)胞中α-SMA蛋白相對(duì)含量明顯降低，分別是對(duì)照的60.82%、46.37%和29.67%(P均＜0.05)，見(jiàn)圖2、圖3。

4 討論

增生性瘢痕是臨床常見(jiàn)的病理性瘢痕，可導(dǎo)致相關(guān)組織或器官功能障礙，運(yùn)動(dòng)受限以及嚴(yán)重的心理創(chuàng)傷［7］。其病理基礎(chǔ)是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分的過(guò)度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積。成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞，它在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中活化、增殖、合成膠原，在正常的傷口愈合過(guò)程中，膠原蛋白的合成代謝與降解代謝之間維持平衡狀態(tài)。但在增生性瘢痕中，成纖維細(xì)胞膠原合成增加、降解減少，打破了這種平衡狀態(tài)，最終導(dǎo)致膠原蛋白的大量沉積，而又以Ⅰ型膠原蛋白的含量最多。

目前研究認(rèn)為，增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展與生長(zhǎng)因子(TGF-β、血小板源生長(zhǎng)因子)活性的增強(qiáng)以及細(xì)胞外基質(zhì)的改變有關(guān)。在增生性瘢痕中，I型膠原蛋白和TGF-β表達(dá)都異常增多［8］。TGF-β是與瘢痕形成最密切的信號(hào)分子，在傷口愈合過(guò)程的功能包括刺激成纖維細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)膠原蛋白合成;抑制肌成纖維細(xì)胞的凋亡，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積;誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，后者具有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征和功能，表達(dá)高水平的α-SMA［9-10］。陳偉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，胎兒傷口無(wú)瘢痕愈合的部分機(jī)制即在于皮膚中TGF-β1的低表達(dá)。TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化主要是通過(guò)Smads信號(hào)通路介導(dǎo)的，ALK5是惟一介導(dǎo)經(jīng)TGF-β膜受體正向調(diào)控Smads信號(hào)通路傳遞TGF-β生物信號(hào)的受體激酶。對(duì)動(dòng)物臟器纖維化模型研究結(jié)果表明，采用小分子抑制劑抑制ALK5活性可降低臟器中纖維化基因表達(dá)和膠原沉積，減少纖維化程度［12］。為探討抑制ALK5活性對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞功能的影響，我們采用已知的高效ALK5特異性抑制劑CP-639180，觀察其對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，CP-639180在體外從轉(zhuǎn)錄水平上抑制I型膠原蛋白的表達(dá)。I型膠原蛋白表達(dá)的多少可以直接反應(yīng)組織瘢痕化的程度。研究還發(fā)現(xiàn)，CP-639180以劑量依賴(lài)模式抑制成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，提示ALK5抑制劑可減少人瘢痕組織中成纖維細(xì)胞向表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的典型標(biāo)志，與創(chuàng)面收縮密切相關(guān)。它通過(guò)纖縱融合膜與成纖維細(xì)胞外纖維粘連蛋白相連，后者可與細(xì)胞外基質(zhì)或其他成纖維細(xì)胞相連，從而把成纖維細(xì)胞的收縮傳導(dǎo)至整塊組織。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用小分子ALK5抑制劑CP-639180可以抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA，進(jìn)一步抑制膠原纖維的合成和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但是，ALK5抑制劑在增生性瘢痕發(fā)生發(fā)展中還存在哪些作用，能否成為新的有效的增生性瘢痕治療方法，仍有待于進(jìn)一步的研究。

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