藍(lán)峻峰，謝濟(jì)運(yùn)

(柳州師范高等專科學(xué)?；瘜W(xué)與生命科學(xué)系，廣西柳州545004)

草藥葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)為大戟科植物的全草，又稱珍珠草、落地油柑、葉后珠、關(guān)門草等，具有平肝清熱、利水解毒之效，常用于治療腸炎、肝炎等炎癥及痢疾、尿路感染、無(wú)名腫痛等［1-2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，葉下珠具有抗乙肝病毒和保肝、護(hù)肝作用［3］。黃酮類化合物分子由具兩個(gè)酚羥基的苯環(huán)通過(guò)居于中央位置的三碳原子相互連接而成，其分子結(jié)構(gòu)中常連接有甲基、甲氧基及酚羥基、異戊烯基等還原基團(tuán)，因此黃酮類化合物具有效清除人體內(nèi)的氧自由基功效，是一種常見的強(qiáng)抗氧劑。黃酮類化合物的生理活性作用較為廣泛，除具有對(duì)心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常的保護(hù)作用外，還具有鎮(zhèn)痛、抗自由基和抗腫瘤等作用［4］。鑒定研究表明，葉下珠植物中含有黃酮類化合物［5］，經(jīng)體外滅活HBV抗原作用實(shí)驗(yàn)證明總黃酮為其抗病毒有效成分之一［6］。

半仿生提取法是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，為經(jīng)人類消化道給藥的中藥及其復(fù)方藥劑創(chuàng)立的一種提取新技術(shù)［7］，該法模仿口服藥物在人體胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，采用選定pH值的酸性和堿性水依次提取得到活性混合物。目前，葉下珠成分提取工藝主要以傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取為主［8］，這些方法提取有機(jī)溶劑殘留量大，副作用高，且提取效率低，成本高。本研究運(yùn)用半仿生法原理，用特定pH的水溶液為溶劑，提取葉下珠黃酮，并用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料及試劑葉下珠草藥，購(gòu)于廣西柳州市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)覃逸明博士鑒定為大戟科葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)全草。蘆丁對(duì)照品(2010-A0103，純度＞98%)，購(gòu)于中國(guó)成都曼思特生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，由實(shí)驗(yàn)室自制;氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉及鹽酸等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器及設(shè)備UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計(jì)，購(gòu)于上海尤尼科儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)于鞏義市予華儀器廠;pHS-3C型精密酸度計(jì)，購(gòu)自上海雷磁儀器廠;SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵，由河南鞏義市英山谷予華儀器廠提供;YJ501型超級(jí)恒溫器，由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠提供;電子天平，由梅特勒-托利多儀器廠提供;遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱，購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備稱取蘆丁對(duì)照品32 mg，用70%乙醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，繼續(xù)用乙醇溶液稀釋、定容，得質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL蘆丁對(duì)照品貯備液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及回歸方程的建立實(shí)驗(yàn)選用蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系吸光法［9-11］制作黃酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的上述2.1項(xiàng)蘆丁對(duì)照品貯備液分別置于6只量瓶中，加入NaNO2溶液還原6 min，隨后加入Al(NO3)3溶液絡(luò)合，再加入NaOH溶液5 mL，用乙醇溶液稀釋、定容，搖勻、顯色10 min后，于波長(zhǎng)為510 nm處，以試劑空白作為參比，用紫外-可見分光光度計(jì)分別測(cè)定上述溶液的吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)(C)，以吸光度值為橫坐標(biāo)(A)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:C=93.889A－0.360 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，曲線中黃酮質(zhì)量濃度線性范圍為0～64 μg/mL。

2.3 半仿生提取

2.3.1 提取溶劑的制備根據(jù)仿生學(xué)原理，人體消化道(胃、小腸、大腸)體液酸度pH分別為2.0、7.5、8.3［12］，因此，實(shí)驗(yàn)中用HCl和Ca(OH)2飽和溶液將提取溶劑pH分別調(diào)為2.0、7.5、8.3，備用。

2.3.2 樣品的處理及制備取葉下珠全草經(jīng)粉碎、過(guò)篩(60目)后，稱取20.00 g于圓底燒瓶中，在一定條件先用pH 2.0的提取劑提取，冷卻后過(guò)濾，收集濾液，所得濾渣分別再用pH 7.5、8.3的提取溶劑各重復(fù)提取一次，冷卻、過(guò)濾，合并提取所得濾液，經(jīng)減壓濃縮得葉下珠提取液。提取液中總黃酮按2.4項(xiàng)的方法測(cè)定。

2.4 黃酮的測(cè)定吸取一定量葉下珠提取液于25 mL量瓶中，按上述2.2項(xiàng)黃酮對(duì)照品質(zhì)量濃度的測(cè)定方法依次加入相應(yīng)的溶液后測(cè)定其吸光度，并計(jì)算總黃酮提取得率。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比等三因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選半仿生法提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素、水平安排如表1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)分別在pH 2.0、7.5、8.3的溶劑中提取一次，合并濾液后測(cè)定黃酮。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按2.3.2項(xiàng)樣品處理及制備的方法，在最優(yōu)工藝條件下提取葉下珠總黃酮，平行實(shí)驗(yàn)3次。

3 結(jié)果及分析

3.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排，提取葉下珠總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析表

從表2中極差R的大小可看出，在實(shí)驗(yàn)考察的三個(gè)因素中，對(duì)黃酮提取得率影響的主次關(guān)系為:A(提取溫度)＞C(料液比)＞B(提取時(shí)間);通過(guò)比較各因素的不同水平的k值，可得半仿生法提取葉下珠黃酮最佳工藝為A3B1C2，即提取溫度85℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比1∶20。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

從表3中可以看出，考察的實(shí)驗(yàn)因素中，在考察的因素水平范圍內(nèi)，溫度對(duì)葉下珠黃酮的提取得率的影響顯著，料液比對(duì)葉下珠黃酮的提取得率有一定的影響，時(shí)間對(duì)葉下珠黃酮的提取得率的影響不顯著。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用正交實(shí)驗(yàn)的最佳工藝條件，即提取溫度85℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比1∶20做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行3次，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均提取得率為1.505%，RSD=0.433%，結(jié)果為所有實(shí)驗(yàn)中最高的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，半仿生提取法用于葉下珠總黃酮的提取，黃酮得率高，方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

4.1 運(yùn)用半仿生法提取葉下珠總黃酮時(shí)，用pH分別為2.0、7.5、8.3的水溶液為提取溶劑各提取一次，用正交實(shí)驗(yàn)考察提取溫度、提取時(shí)間和提取料液比對(duì)提取得率的影響，結(jié)果表明:在考察的因素水平范圍內(nèi)，溫度對(duì)葉下珠黃酮提取得率影響顯著，時(shí)間對(duì)葉下珠黃酮提取得率影響不顯著，料液比對(duì)黃酮得率有一定的影響。各因素對(duì)黃酮提取得率的影響大小次序?yàn)?提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。葉下珠總黃酮的最佳提取工藝條件為:提取溫度85℃，料液比1∶20，提取時(shí)間1.5 h。用此工藝提取葉下珠黃酮提取得率較高，可達(dá)1.505%，優(yōu)于文獻(xiàn)顯示的傳統(tǒng)方法提取效果［13］。

4.2 與傳統(tǒng)的提取方法比較，半仿生提取法模擬人體口服給藥過(guò)程，以不同pH的水溶液為提取溶劑，不使用有機(jī)溶劑，減少對(duì)環(huán)境及生產(chǎn)操作人員的身體傷害，對(duì)環(huán)境友好，易于實(shí)現(xiàn)綠色化生產(chǎn)，且提取得率較高，利于降低生產(chǎn)成本。

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