徐虹，孫華

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一組Zn2+依賴性蛋白酶，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種，根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為五大類，即基質(zhì)溶解酶、膠原酶、明膠酶、膜型酶和其他不能分類的基質(zhì)酶，其主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，在正常的胚胎發(fā)育和組織重塑等生理過(guò)程以及一些疾病的病理生理中起重要作用。通過(guò)降解ECM，MMPs可以對(duì)血腦屏障產(chǎn)生的損害，加重腦水腫和出血。MMPs家族可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化、腦外傷、腦炎、腦膜炎、腦血管病變等多種疾病的病理過(guò)程。在腦缺血神經(jīng)炎癥時(shí)可因細(xì)胞因子等的刺激，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)大量釋放，進(jìn)而在缺血局部浸潤(rùn)形成炎性反應(yīng)，使血腦屏障通透性增高，并可能參與腦缺血后的繼發(fā)性損傷[1]。MMP-9主要在內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和白細(xì)胞表達(dá)，幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，在腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury)急性期加重血腦屏障破壞，參與腦水腫和腦出血的組織損傷過(guò)程[2]。組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)為特異性的抑制因子，在一些生理和病理過(guò)程中，細(xì)胞分泌MMPs同時(shí)也分泌TIMPs，在體內(nèi)與MMPs同步表達(dá)，二者以1∶1的形式構(gòu)成復(fù)合體。因此各種TIMPs成為目前腦缺血再灌注損傷治療的重要突破點(diǎn)。

1 MMP-9的來(lái)源和表達(dá)

1.1 MMP-9的來(lái)源 MMP-9分子量Mr 92×103，活性分子量為83 kDa，又稱為明膠酶B，其基本結(jié)構(gòu)包括信號(hào)肽區(qū)、N-末端前肽區(qū)、催化基團(tuán)區(qū)、C-末端血紅素結(jié)合蛋白樣區(qū)和鉸鏈區(qū)。一經(jīng)合成即以無(wú)活性形式從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，且主要由纖溶酶原激活物活化，最后在體內(nèi)由特殊的蛋白酶切割而產(chǎn)生活性。相關(guān)研究從MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)、MMP-9基因敲除大鼠等不同途徑探討MMP-9的可能來(lái)源，但是它的細(xì)胞來(lái)源始終沒(méi)有被完全認(rèn)識(shí)。

1.2 MMP-9在腦組織中的表達(dá) 目前研究提示腦實(shí)質(zhì)成分如內(nèi)皮細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元都可表達(dá)MMP-9。相關(guān)研究顯示，在腦缺血后1~3 d，MMP-9在缺血核心區(qū)(紋狀體和皮層)表達(dá)增加，在腦缺血的急性期，MMP-9主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，其次是在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞[1]。也有研究顯示，因腦缺血再灌注損傷后的MMP-9不是局部產(chǎn)生的，可能是從循環(huán)中的細(xì)胞通過(guò)血液通路傳遞過(guò)來(lái)，中性粒細(xì)胞是MMP-9的主要來(lái)源[2]。支持這一觀點(diǎn)的是，有學(xué)者用細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecular 1,ICAM-1)抗體阻止中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附或誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞減少癥，結(jié)果表達(dá)95 kDa MMP-9的中性粒細(xì)胞數(shù)明顯減少[3]。除此之外，體外實(shí)驗(yàn)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞也被認(rèn)為參與腦缺血再灌注損傷，并且可能和腦缺血后出血轉(zhuǎn)歸有關(guān)[4]。另外，在腦缺血修復(fù)期(7~14 d)，和MMP-9共表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元還有可能參與了腦缺血的修復(fù)過(guò)程[1]。因此，從MMP-9的來(lái)源來(lái)看，目前的結(jié)論并不一致，結(jié)果的差異可能與體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的差異、動(dòng)物的年齡、細(xì)胞培養(yǎng)的條件(尤其是其他細(xì)胞基質(zhì)蛋白如纖連蛋白、玻連蛋白等的存在)、是否能夠排除內(nèi)源性基質(zhì)蛋白酶表達(dá)等因素相關(guān)。因此，最大程度地控制實(shí)驗(yàn)條件，從形態(tài)學(xué)、分子水平及蛋白水平多個(gè)角度探討MMP-9的來(lái)源可能是今后研究的方向。

2 MMP-9表達(dá)的調(diào)控及基因多態(tài)性

2.1 MMP-9表達(dá)的調(diào)控機(jī)制 MMPs的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格調(diào)控，主要在以下兩個(gè)水平進(jìn)行：①轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)：在MMPs的合成過(guò)程中，mRNA的表達(dá)受生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素等多種因素調(diào)節(jié)。白介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等促進(jìn)MMPs合成，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、地塞米松、干擾素(IFN)-γ、肝素等抑制MMPs合成；②酶原激活水平：一般認(rèn)為MMPs以無(wú)活性酶原形式分泌，只有被活化才能降解ECM。MMPs的酶原活化機(jī)制主要有3個(gè)方面，分別為細(xì)胞內(nèi)活化、被MT-MMPs(包括MMP-14、MMP-15、MMP-16)活化和逐級(jí)活化。目前研究結(jié)果表明，MMPs的活化機(jī)制可能為：在尿激酶-纖溶酶原活化劑或組織纖溶酶原活化劑催化下變成纖溶酶，纖溶酶可部分激活間質(zhì)膠原酶和基質(zhì)分解素。

2.2 MMP-9的基因多態(tài)性 人類MMP-9基因位于16q 11.2~13.1，全長(zhǎng)7.7 kb，含13個(gè)外顯子。已發(fā)現(xiàn)在MMP-9基因中存在多個(gè)序列變異，其中關(guān)于C-1562/T多態(tài)位點(diǎn)的研究報(bào)道較多。MMP-9c-1562T多態(tài)性是MMP-9基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游的1562處存在的C被T取代。因啟動(dòng)子是參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)的調(diào)節(jié)序列，因此，這些多態(tài)性的發(fā)生可能直接影響到MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄能力，這一推測(cè)目前已被一些研究證實(shí)。Zhang等發(fā)現(xiàn)MMP-9啟動(dòng)子的多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的程度相關(guān)，因C等位基因可與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)合，而T等位基因可不與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)合，從而表現(xiàn)出更高的啟動(dòng)子活性，引起MMP-9基因轉(zhuǎn)錄增加[5]。因此，MMP-9的不同基因型有可能作為基因背景，決定了不同人群對(duì)于某些疾病具有不同的易感性和不同的臨床特征。由于MMP-9的重要生物學(xué)作用及其基因的特殊位置，MMP-9的基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)系受到普遍重視。不同MMP-9基因型的個(gè)體在功能上還可能存在差異，國(guó)外已有學(xué)者開(kāi)始對(duì)MMP-9的基因多態(tài)性與一些疾病的相關(guān)性進(jìn)行研究，初步的研究結(jié)果表明，MMP-9的基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性。MMP-9啟動(dòng)子區(qū)還存在一個(gè)-90(CA)n的多態(tài)性。這個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性在人群中以等位基因(CA)14最多見(jiàn)，其次為等位基因(CA)21、(CA)22和(CA)23。啟動(dòng)子活性體外實(shí)驗(yàn)表明，在成纖維細(xì)胞中，含(CA)14的啟動(dòng)子活性只有含(CA)23啟動(dòng)子的60%左右。

3 MMP-9與腦缺血

研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)增多，纖維成分大量降解，使斑塊破潰，形成附壁血栓，容易脫落，導(dǎo)致腦缺血發(fā)生，免疫組化和原位雜交研究證實(shí)，斑塊中巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)MMP-9及其mRNA表達(dá)明顯增加。臨床試驗(yàn)中，Loftus等將70例動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)患者分為4組(Ⅰ組無(wú)癥狀，Ⅱ組出現(xiàn)癥狀>6個(gè)月，Ⅲ組出現(xiàn)癥狀1~6個(gè)月，Ⅳ組1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)癥狀)，對(duì)所取斑塊行MMP-9的定量測(cè)定，結(jié)果顯示，Ⅳ組MMP-9水平顯著高于對(duì)照組[6]。Kalela等觀察到血漿MMP-9水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)，MMP-9水平越高，狹窄越重，提示血漿MMP-9可作為動(dòng)脈粥樣硬化及腦梗死等病情活躍的標(biāo)志物及隨訪指標(biāo)[7]。動(dòng)物研究表明，MMP-9的表達(dá)在局灶性腦缺血模型中24~48 h到達(dá)高峰[8]。在永久性大鼠腦缺血模型中，MMP-9的表達(dá)呈雙峰型，即在10~15 h及24 h達(dá)到高峰。過(guò)去的研究多在1周范圍內(nèi)研究MMP-9的表達(dá)情況，通常認(rèn)為MMP-9在腦缺血損傷中的作用是負(fù)面的。同時(shí)，血漿中MMP-9在腦缺血再灌注損傷后1 h也有升高[9]。最近，有文章探討MMP-9在7~14 d內(nèi)表達(dá)的情況，發(fā)現(xiàn)MMP-9在7~14 d可以出現(xiàn)另外一個(gè)高峰，而且表達(dá)的區(qū)域也由梗死核心區(qū)轉(zhuǎn)移到缺血周圍地帶，提示這可能與MMP-9參與腦缺血后神經(jīng)損傷功能的修復(fù)有關(guān)[2]。與此符合的是，我們之前研究結(jié)果表明I/R后腦組織中MMP-9的表達(dá)成雙峰形表達(dá)(第1峰在48 h，第2峰在144 h)[10]。因此目前研究證實(shí)：①M(fèi)MP-9和腦缺血關(guān)系十分密切，腦缺血再灌注損傷發(fā)生的急性期(數(shù)小時(shí)至48 h)和恢復(fù)期(7~14 d)，MMP-9在腦缺血區(qū)域(缺血皮質(zhì)和紋狀體)出現(xiàn)升高，其表達(dá)有可能呈現(xiàn)雙峰形態(tài)，第1個(gè)峰值可能與急性期損傷相關(guān)，第2個(gè)峰值則可能參與了組織的修復(fù)過(guò)程；②不僅在缺血腦組織局部MMP-9表達(dá)，在獨(dú)立于血腦屏障的外周血中，MMP-9也有輕微的表達(dá)；③MMP-9的表達(dá)量和動(dòng)物神經(jīng)功能、腦梗死的嚴(yán)重程度等呈正相關(guān)。

4 MMP-9與出血轉(zhuǎn)歸

腦缺血后的溶栓治療是目前急性腦缺血的治療措施之一。但是溶栓治療長(zhǎng)期以來(lái)受人質(zhì)疑的一個(gè)原因是其會(huì)增加隨后腦出血的風(fēng)險(xiǎn)。MMP-9被認(rèn)為參與溶栓治療后腦出血及腦水腫的病理過(guò)程。腦缺血發(fā)生后，溶栓治療的患者可激活內(nèi)源性及外源性的纖溶酶原激活物(tPA)，tPA可能通過(guò)LDL受體介導(dǎo)的蛋白通路(LDL receptor related protein,LRP)及蛋白激酶激活受體通路(proteinase activated receptor 1,PAR1)使MMP-9表達(dá)升高，從而加重腦缺血損傷、神經(jīng)死亡及血腦屏障破壞的程度[11]。Castellanos等發(fā)現(xiàn)腦梗死出血轉(zhuǎn)化患者血漿MMP-9濃度明顯高于未繼發(fā)出血患者，因此認(rèn)為血漿MMP-9水平增高與急性腦梗死出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生密切相關(guān)[12]。Montaner等檢測(cè)了39例心源性卒中患者血清MMP-9水平，根據(jù)CT檢查結(jié)果，將出血轉(zhuǎn)化分為出血性梗死和實(shí)質(zhì)性血腫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9水平與遲發(fā)性出血轉(zhuǎn)化有關(guān)，且是唯一的預(yù)測(cè)因子，實(shí)質(zhì)血腫組MMP-9在24 h時(shí)達(dá)高峰[13]。據(jù)此他們認(rèn)為，MMP-9水平可預(yù)測(cè)遲發(fā)性出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生，24 h時(shí)MMP-9水平增高往往預(yù)示著會(huì)出現(xiàn)血腫。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，在小鼠腦出血模型中，若在野生型小鼠紋狀體內(nèi)注射MMP-9基因敲除小鼠的血液，就可以明顯緩解腦出血的癥狀[14]，且MMP-9基因敲除的小鼠在早期的腦缺血再灌注損傷中出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生率較野生型小鼠低[15]。但也有不一致的結(jié)論，腦缺血后應(yīng)用重組纖溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)的副作用(血腦屏障的破壞等)也可能與MMP-9無(wú)關(guān)[16]。從目前研究來(lái)看，無(wú)論是臨床還是實(shí)驗(yàn)研究均支持MMP-9水平可以反映腦缺血損傷后出血轉(zhuǎn)歸的可能性。

5 MMP-9及其抑制劑

MMP-9只有在解朊后才能在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮損傷作用，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)人為因素在轉(zhuǎn)錄、激活、切割以及抑制等水平調(diào)節(jié)其活動(dòng)。目前研究較多的是其抑制劑。目前發(fā)現(xiàn)的金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)分4型：TIMP-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP以1∶1的化學(xué)計(jì)量關(guān)系與活化的MMPs結(jié)合，抑制其話性。在TIMP與MMPs之間存在一定程度的抑制特異性。TIMP-1抑制大多數(shù)MMPs的活性，但不包括MMP-2；TIMP-2也是大多數(shù)MMPs抑制因子，但是不包 括 MMP-9； TIMP-3 抑 制 MMP-1， MMP-2， MMP-3，MMP-9，MMP-13的活性。腦缺血和(或)再灌注時(shí)，MMP-9異常升高，破壞血腦屏障，參與血管源性腦水腫和出血轉(zhuǎn)化的形成，MMP-9也可能成為穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和防治卒中的新靶點(diǎn)。因此，人為地調(diào)節(jié)MMP-9和TIMP-1之間的平衡，減少M(fèi)MP-9或增加TIMP-1的含量、功能和活性，或使用人工合成的TIMPs有望成為一種治療缺血性腦血管病的新手段。

Mishiro等聯(lián)合應(yīng)用tPA和一種新型的廣譜MMPs抑制劑研究腦缺血大鼠模型，結(jié)果表明，聯(lián)合治療可能通過(guò)對(duì)緊密連接蛋白(tight junction proteins,TJPs)的保護(hù)，減少應(yīng)用tPA 7 d后大鼠的死亡率[17]。Liu等選用選擇性的MMP-2/9抑制劑SB-3CT，說(shuō)明其在腦缺血早期可以通過(guò)調(diào)節(jié)閉鎖蛋白的降解和閉鎖蛋白-5的重新分配減緩腦缺血損傷[18]。Kanazawa等研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth,VEGF)在腦缺血后表達(dá)升高，激活MMP-9，因此VEGF的抑制劑也可能成為減少腦水腫、神經(jīng)損傷及減輕應(yīng)用tPA后出血轉(zhuǎn)化的新途徑[19]。此外，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)體外動(dòng)物腦缺血模型中具有保護(hù)作用，但是到目前為止，機(jī)制不明。有學(xué)者研究在腦缺血中，調(diào)整信號(hào)分子Janus激酶2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白-3(signal transducers and activators of transcription protein-3,STAT-3)以及TIMP-1可能是紅細(xì)胞生成素(EPO)誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用的主要介質(zhì)[20]。同時(shí)，也有相當(dāng)?shù)难芯繄?bào)道，可以通過(guò)干預(yù)炎癥因素調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)，最終減輕腦缺血再灌注損傷[21]。另外，自由基抑制劑、Rho激酶抑制劑、間斷的頸內(nèi)動(dòng)脈生理鹽水灌注等被認(rèn)為可以通過(guò)降低MMP-9表達(dá)減輕腦缺血再灌注損傷[22-24]。但是也有報(bào)道稱，MMP-9及其抑制劑在腦缺血中的作用可以是雙向的，即既可以加重腦缺血損傷，也可能參與損傷的修復(fù)過(guò)程。因此多數(shù)文獻(xiàn)支持，腦缺血再灌注損傷之后血腦屏障的損傷可由3個(gè)方面產(chǎn)生：①腦缺血后外源性的tPA；②損傷后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，如氧自由基等；③血腦屏障降解酶類，如MMPs家族。大多數(shù)的研究者試圖從MMPs的廣譜或者非廣譜的抑制劑、氧自由基拮抗劑以及tPA受體拮抗劑等方面保護(hù)血腦屏障。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明，MMP-9表達(dá)水平是反應(yīng)腦缺血再灌注損傷后腦缺血損傷程度、腦梗死面積以及預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。目前對(duì)MMP-9的干預(yù)還處在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，通過(guò)影響MMP-9的上游信號(hào)，找到有效干預(yù)MMP-9表達(dá)的方法，對(duì)腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究及預(yù)防治療具有重要意義。

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