劉青梅 韓 輔 (長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的發(fā)病目前認為主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素的相互作用有關(guān)。細胞因子在UC發(fā)病中發(fā)揮重要作用。目前認為減少一氧化氮(NO)產(chǎn)生，抑制誘導型NO合成酶(iNOS)表達可能是治療UC的有效靶點之一。本實驗主要觀察中藥腸康顆粒對UC大鼠NO水平及NOS活力的影響，從而進一步驗證該藥療效，探討其治療UC的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 采用Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，由吉林大學醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗藥品 腸康顆粒由干姜、白術(shù)、桂枝、茯苓、肉豆蔻、烏梅、五味子等組成，由長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心藥物制劑研究室加工;柳氮磺吡啶(上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號H31020557);5%三硝基苯磺酸(TNBS)水溶液購自Sigma公司;乙醇為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要試劑 NO試劑盒、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn));雙蒸水(吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院自制)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為乙醇對照組、模型組、腸康顆粒低、中、高劑量組，柳氮磺吡啶(SASP)組，每組10只。乙醇對照組以50%乙醇0.25 ml灌腸;其余5組以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸。

1.2.2 模型制備 所有動物禁食48 h后，乙醚麻醉，取12 cm聚丙烯管(直徑2 mm)，剪側(cè)孔數(shù)處，并由肛門插入結(jié)腸8 cm達結(jié)腸部位，快速注入藥液后，捏緊肛門，提取大鼠尾巴保持倒立1 min，以防注入液倒流，待麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。

1.2.3 給藥方法 腸康顆粒低、中、高劑量組分別按生藥11、22、44 g/kg劑量，用無菌蒸餾水調(diào)制成溶液灌胃(正常人用量換算成大鼠劑量的5、10及20倍);SASP組按0.5 g/kg劑量，用無菌蒸餾水調(diào)制成溶液灌胃，灌胃體積均為10 ml/kg;乙醇對照組及模型組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第3天開始灌胃，每日一次，連續(xù)21 d。

1.2.4 標本取材 連續(xù)灌胃21 d后，麻醉各組大鼠，腹主動脈無菌取血，經(jīng) 3 500 r/min，15 min低溫離心，分離血清，－20℃保存，按試劑盒說明書檢測血清NOS水平。取肛門至盲腸部結(jié)腸(約8 cm)，沿腸系膜縱軸剪開，取腸組織一部分，除去血液，濾紙吸干，稱重，在預(yù)冷的pH7.4的勻漿介質(zhì)中制成10%勻漿，4 000 r/min離心15 min，取上清液，置－20℃保存，以備檢測NO含量。

1.2.5 檢測指標

1.2.5.1 結(jié)腸黏膜NO水平測定 運用硝酸還原酶法檢測NO含量。試劑盒說明書操作。計算公式:NO含量(μmol/gprot)=(測定管吸光度－空白管吸光度)/(標準管吸光度－空白管吸光度)×標準品濃度 ×樣本的蛋白含量(mgprot/ml)。

1.2.5.2 血清NOS活力測定 運用硝酸還原酶法檢測血清NOS活力，嚴格按說明書操作?？侼OS活力(U/ml)=(總NOS測定管OD值－空白管OD值)/呈色物納摩爾消光系數(shù)×(反應(yīng)液總體積/取樣量)×1/(比色光徑×反應(yīng)時間)÷1 000

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 NO含量變化 與乙醇對照組 NO含量〔(1.67±0.07)μmol/gprot〕相比，其他各組大鼠結(jié)腸組織NO含量明顯增高(P＜0.01)。與模型組〔(4.33±0.49)μmol/gprot〕相比，腸康顆粒低、中、高劑量組〔(2.78±0.29)、(2.52±0.12)、(2.11 ± 0.21)μmol/gprot〕 及 SASP 組 〔(2.43±0.13)μmol/gprot〕NO含量明顯降低(P＜0.01)。高劑量組的NO含量較低劑量組明顯下降(P＜0.01)。

2.2 血清中NOS活性 模型組〔(49.39±6.54)U/ml〕、腸康顆粒 低 〔(35.89 ±3.16)U/ml〕、中 劑 量 組 〔(30.78 ±2.96)U/ml〕及 SASP 對照組〔(26.37 ±3.50)U/ml〕與乙醇對照組〔(17.68±3.03)U/ml〕相比，NOS活性明顯增強(P＜0.01)。高劑量組〔(21.15±3.60)U/ml〕與乙醇對照組相比，NOS活性也增強(P＜0.05)。與模型組對比，其他各治療組的NOS活性明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.01)。與低劑量組比較，高劑量組及SASP對照組的NOS活性明顯降低(P＜0.01);中劑量組與低劑量組相比，NOS活性也明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

NO是一種免疫分子和炎癥介質(zhì)，也是一種自由基。NO在UC炎癥過程中充當了雙重角色，既有保護作用，又有殺傷毒性和促炎作用。在炎癥初期，可抑制激活的巨噬細胞和T細胞的功能，并能抑制血小板聚集，防止血栓形成;同時抑制髓過氧化物酶的活性，保護上皮屏障及促進上皮修復。隨著炎癥的持續(xù)和發(fā)展，大量的NO釋放到組織，此時NO主要發(fā)揮組織損傷作用。NO由NOS催化L-Arg產(chǎn)生，UC病變黏膜中，NOS活性增高及NO濃度的增加與炎癥程度呈平行關(guān)系。體內(nèi)NOS分結(jié)構(gòu)型(cNOS)和誘導型(iNOS)兩大類，在UC結(jié)腸黏膜層主要以iNOS為主。cNOS是鈣離子和鈣調(diào)蛋白依賴性酶，存在于機體部分神經(jīng)元，血管內(nèi)皮細胞中具有穩(wěn)定的活性，持續(xù)釋放少量NO作為神經(jīng)遞質(zhì)，起局部血流調(diào)節(jié)作用，對腸黏膜具有保護作用。iNOS是一種誘生酶，靜息狀態(tài)下不表達，當細胞接受各種刺激，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)，可使其表達大量增加〔1，2〕，合成大量 NO。iNOS 持續(xù)時間很長，催化的NO對腸黏膜有殺傷毒性及促炎作用。NO具有趨化中性粒細胞和單核細胞作用，并可與超氧陰離子反應(yīng)生成具有高度細胞毒性的過氧亞硝酸鹽，破壞細胞的功能和結(jié)構(gòu);過量的NO還可使血管擴張，通透性增加，導致黏膜充血、水腫，有助于炎癥的始動與發(fā)展〔3，4〕。研究表明〔5，6〕，在 UC 患者活動期腸黏膜組織及血清中NO含量均有增加，且活動期UC患者病變黏膜炎癥嚴重程度與iNOS和NO濃度有關(guān);在重度UC病變黏膜，iNOS和NO的濃度比輕度UC者明顯增高。過量的NO可能影響腸道免疫功能并產(chǎn)生細胞毒作用，如可導致細胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)巰基氧化、亞硝基化及DNA鏈斷裂等。Middleton等〔7〕發(fā)現(xiàn)活動期UC患者腸灌液亞硝酸鹽濃度異常增多，結(jié)腸iNOS活性明顯增強，NOS抑制劑可明顯改善結(jié)腸損傷的范圍和程度。因此，抑制iNOS表達減少NO產(chǎn)生可能是治療UC的有效靶點之一。李軍華等〔8〕采用免疫組織化學染色檢測腸組織iNOS表達，生化方法檢測NO含量，結(jié)果顯示，與正常組及生理鹽水組相比，UC大鼠腸組織中iNOS表達及NO含量顯著增高(P＜0.01)，且在病情嚴重組增高尤為明顯，認為iNOS可能參與了UC發(fā)生、發(fā)展。劉少平等〔9〕采用免疫組化方法檢測結(jié)腸組織NO、過氧化物酶(MPO)、前列腺素E2(PGE2)含量及cNOS、iNOS的表達水平，結(jié)果阿魏酸鈉(200、400、800 mg/kg)灌腸用藥均降低模型組大鼠升高的結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)及結(jié)腸組織NO、MPO、PGE2含量，下調(diào)iNOS過度表達，亦抑制cNOS正常表達，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

本研究中UC大鼠結(jié)腸組織NOS活性及NO含量顯著升高，表明增多的NO主要來源于NOS。腸康顆粒給藥后，NOS、NO均下降，提示腸康顆?？赡苤饕ㄟ^抑制NOS表達減少NO生成，從而減輕NO引起的損傷。本研究結(jié)果亦表明腸康顆粒對NOS、NO的降低程度與用藥呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

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