任彥榮

(重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶400067)

青蒿素是一種具有高效抗瘧作用的活性成分，在臨床上得到廣泛的應用。但由于其油溶性和水溶性均較差，很難制成合適的劑型，加之復燃率高等缺點，限制了其臨床應用。因此通過對青蒿素進行結構修飾以期得到性能理想的衍生物成為研究的熱點。從上世紀七十年代開始到現在，已經合成了成千上萬種青蒿素衍生物。合成的思路主要基于以下兩個方面:(1)保留過氧橋活性中心，主要對12位碳原子進行修飾，將親脂性、親水性基團引入結構中改善溶解性，基團主要有醚類、酯類和雜原子取代等。(2)合成雙活性基團衍生物。通過雙青蒿素分子間脫水，以及用二元酸、二元醇為連接鏈段的青蒿素酯類或醚類二聚體;或者將具有生理活性的大分子如甾體等引入青蒿素結構中，以增強穩(wěn)定性。雖然目前已合成出眾多衍生物，但仍然沒找到比目前上市的蒿甲醚、蒿乙醚、雙氫青蒿素和青蒿琥酯效果更好的化合物。而且動物實驗發(fā)現大劑量長期使用上述藥物，可引發(fā)中樞神經系統損害及心電圖的變化，這些藥物仍具有復燃率高、半衰期短及口服生物利用度低等缺點。青蒿琥酯在水中不穩(wěn)定，必須用前溶解于碳酸氫鈉制成鈉鹽，使用不方便。因此如何更好地解決以上問題，尋找溶解性更好、毒理作用更小的衍生物，具有重要的意義。由于糖是生物體內重要的活性物質，具有良好的溶解性能和多種生理藥理功能，近年來在藥物修飾中得到廣泛應用。另有研究顯示酶催化合成反應具有諸多優(yōu)點，如反應條件較溫和、對環(huán)境較友好，目標產物簡單、具有高度區(qū)域和立體選擇性，且易于分離純化，合成路線簡化。因此，本研究基于糖基轉移酶催化糖苷化反應的原理，采用生物酶催化的方法對青蒿素進行糖基化修飾。由于糖基轉移酶具有嚴格的底物專一性［1］，以應用廣泛的半乳糖為底物，確定了優(yōu)化的反應條件，最終合成一種半乳糖基青蒿素衍生物(見圖1)，然后對其結構進行鑒定，相關研究證實，青蒿素及其衍生物可明顯抑制癌細胞活性［2-6］，基于此，本研究檢測了其體外抗癌活性。

圖1 合成路線Fig.1 Synthetic route of glycosylated artemisinin

1 材料與儀器

1.1 藥物與儀器青蒿素購自中國藥品生物制品檢定所;半乳糖、半乳糖基轉移酶為國藥集團化學試劑廠產品;IMDM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;胰酶、蛋白酶K、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)均為Sigma公司產品。由Varian INOVA-400型核磁共振儀測定1HNMR;由Finnigan-MAT 4510型質譜儀測定MS;由美國熱電Varon傅立葉紅外光譜儀測定IR。

1.2 細胞株人宮頸癌HeLa細胞株由第三軍醫(yī)大學實驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 合成方法確定和工藝條件優(yōu)化本研究選擇在食品中常見的、應用廣泛的葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖為底物。因目前商品化的糖基轉移酶并不多，本研究選擇底物專一性很強的半乳糖糖基轉移酶催化半乳糖底物，葡糖基轉移酶催化其他3種底物。采用薄層層析法對糖基化反應的可行性進行初步驗證。結果顯示，以核糖和果糖為底物時沒有產生糖基化衍生物，而葡萄糖和核糖會發(fā)生微量自聚集現象，影響產物質量。而以半乳糖為底物時，催化反應效率最高，底物較穩(wěn)定，無自聚現象。因此最終確定以半乳糖為底物。

通過對生物酶催化合成青蒿素半乳糖苷的反應條件進行優(yōu)化，分析了不同緩沖體系、溫度、時間以及攪拌速率對反應的影響。結果顯示，緩沖體系的pH值與酶催化反應關系最為密切，pH值在7～8范圍其酶活性最好。反應溫度、時間、半乳糖用量及攪拌速率等因素均對反應的效率有一定影響。根據青蒿素半乳糖苷糖基化百分率，確定最佳反應條件為:10 mL反應體系中，采用pH為7.4的磷酸緩沖液，半乳糖10 mmol，反應溫度32℃，攪拌速率(轉速)200 r/min，反應時間6 h。

2.2 青蒿素半乳糖苷的酶催化合成與表征以半乳糖為給體原料，半乳糖糖基轉移酶作為催化酶，按文獻［7］的方法制備半乳糖尿苷酸(UDP)衍生物的糖基給體。將5 mmol(1.410 7 g)二氫青蒿素溶于50 mmol/L的NaN3中，加入UDP活化的10 mmol半乳糖糖基給體及5 μmol半乳糖糖基轉移酶，磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋至10 mL，32℃、200 r/min孵育6 h。然后在50 mmol/L的NaN3和磷酸緩沖液(pH7.4)中充分透析，以去除未結合的糖分子。本合成反應在NaN3保護體系中進行，可防止反應體系與空氣中的O2接觸發(fā)生氧化。結果顯示半乳糖糖基化百分率達68%，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測證實，產物達到電泳純的純度。

合成產物的表征數據:1H NMR(CDCl3)δ:5.44(s，1H，CH)，4.96(d，1H，J=6.7 Hz，CH)，4.92(d，1H，J=3.4 Hz，CH)，3.43～3.76(m，6H，CH and CH2，為糖環(huán)質子信號)，1.26(s，3H，CH3)，0.91(d，3H，J=6.5 Hz，CH3)，0.82(d，3H，J=6.2 Hz，CH3);13C NMR(CDCl3):8.5，14.5，16.6，18.7，19.5，24.8，27.2，30.1，30.8，30.5，31.7，62.5，68.1，69.0，73.1，72.1，84.3，92.4，92.8，96.1，97.9;LCMS(APCI:CHCl3)m/z(%):445.48(M-1+，100);IR(KBr cm－1)Vmax:3 380，2 946，2 935，1 135，1 027，1 014。

1H NMR中δ5.44、4.92、1.26、0.91、0.82與二氫青蒿素的特征吸收峰相同，δ4.96為連接二氫青蒿素的半乳糖分子端基碳上的H原子，其J值為6.7 Hz，表明半乳糖端基C為β構型。13C NMR譜中共有21個信號(溶劑峰除外)，每分子青蒿素半乳糖苷共有21個碳原子，其中15個位于母體青蒿素分子，6個位于半乳糖分子，由此可確定目標產物為青蒿素半乳糖苷。

2.3 青蒿素半乳糖苷體外抗癌作用

2.3.1 青蒿素半乳糖苷對癌細胞抑制作用以青蒿素作對照，用MTT法測定青蒿素半乳糖苷的對癌細胞活性的抑制作用。根據文獻［8］，IMDM培養(yǎng)液將青蒿素半乳糖苷或青蒿素稀釋配成40 μmol/L的工作液;單層培養(yǎng)的HeLa細胞經胰蛋白酶消化后配成單細胞懸液，接種于96孔板，密度4×104個/孔，每孔200 μL，37℃、5%CO2、相對濕度100%條件下培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入青蒿素半乳糖苷或青蒿素工作液，繼續(xù)培養(yǎng)8、12、24、48、72 h。結束培養(yǎng)4 h前，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，孵育，終止培養(yǎng)后棄上清培養(yǎng)液，加入DMSO，振蕩，酶標儀檢測492 nm和630 nm波長吸光度值A，按下述公式計算癌細胞抑制率，結果以均數±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件對組間結果進行t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果如圖2所示，青蒿素半乳糖苷可顯著抑制HeLa細胞的生長，并且抑制效果顯著高于青蒿素對照組(P＜0.01)。隨著青蒿素半乳糖苷處理細胞的時間延長，抑制率逐漸增大，表明在一定范圍內，其對癌細胞抑瘤效果具有明顯的時間效應關系。

圖2 青蒿素半乳糖苷與青蒿素對HeLa細胞的抑制作用比較Fig.2 Inhibitory action of galactosylated artemisinin and artemisinin on proliferation of He-La cell

2.3.2 青蒿素半乳糖苷對癌細胞凋亡的影響樣本細胞數調至1.5×106mL－1，孵育緩沖液(CaCl25 mmol/L，HEPES/NaOH 10 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，pH7.4)洗1次，避光室溫孵育15 min，孵育緩沖液洗1次，滴加Hoechst33342和PI染液，4℃孵育20 min，熒光顯微鏡觀察，波長488 nm和560 nm激發(fā)光分別檢測Hoechst33342和PI。

結果如圖3，HeLa細胞經藥物作用48 h后，青蒿素半乳糖苷處理的癌細胞呈現大量濃染或碎裂染色特征的細胞核，表明大量凋亡細胞出現，而青蒿素處理的HeLa細胞呈均一染色的正常細胞核較多，而呈現上述凋亡現象的細胞較少，表明青蒿素半乳糖苷可顯著誘導癌細胞凋亡，其效果明顯優(yōu)于青蒿素。

圖3 青蒿素半乳糖苷對癌細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of galactosylated artemisimin on apoptosis of cancer cell

3 討論

目前關于青蒿素糖基化的酶催化合成沒有相關的文獻報道，本研究首次利用糖基轉移酶來催化青蒿素的糖基化反應，最終產物經過表征，確定其為青蒿素半乳糖苷。與化學合成方法相比，利用酶催化反應可大幅度提高合成效率，而且半乳糖轉移酶的底物專一性很強，僅催化半乳糖基給體發(fā)生反應。另外，酶催化合成青蒿素糖基化衍生物還具有反應條件溫和，操作方便易行，合成過程中無毒性物質產生，目標產物易于分離純化、純度高等優(yōu)勢，具有推廣意義。雖然利用糖基轉移酶合成青蒿素半乳糖苷類化合物具有一些化學方法所無可比擬的優(yōu)勢，但仍然存在一些問題，如原料價格較為昂貴，造成其應用的成本高，難以規(guī)?；瘧?另外，酶的穩(wěn)定性和溶解性在后續(xù)研究中還有待改進，可通過固化、生物反應器等方法，使其能夠規(guī)模化生產，這都是未來需解決的問題。

本研究進一步研究了青蒿素半乳糖苷的抗癌活性。目前關于青蒿素及其衍生物抗腫瘤的機制尚未完全闡明［9-10］，文獻報道的機制顯示關鍵可能在于細胞周期的調控［11-13］。本研究將糖基化青蒿素與青蒿素比較，初步探討了兩者對癌細胞的作用。根據文獻［8］中青蒿素抗腫瘤實驗結果，以及前期研究［14］，得出了不同劑量(10、20、40、80、160、320 μmol/L)半乳糖基化青蒿素作用于人宮頸癌HeLa細胞48 h的劑量-效應關系。結果顯示，濃度40 μmol/L最為接近引起50%細胞死亡(IC50)的濃度，所以本研究以IC50濃度40 μmol/L作為效應濃度。實驗結果顯示半乳糖基化修飾后青蒿素衍生物與青蒿素相比抗腫瘤作用顯著提高，具有明確的誘導腫瘤細胞凋亡的作用，這可能與糖基化修飾后青蒿素衍生物水溶性、親和性或者生物利用效率的提高有關，但其具體機制尚需進一步研究。該研究不僅為糖基化修飾的青蒿素衍生物合成提供了新的方向，也為明確青蒿素半乳糖苷的抗癌活性提供了初步依據。

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