周雅琴 余麗瑩 譚小明

廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023

鐵皮石斛 (Dendrobium candidum Wall．ex lindl)又名黑節(jié)草、鐵皮蘭，為多年生附生型草本植物，屬國家2級保護的名貴瀕危藥材［1］， 《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品［2］，在《本草綱目》中也被收錄。現(xiàn)代藥理研究表明，石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強人體免疫力和擴張血管的功效［3］。由于受特殊的生物學及生態(tài)學特性限制，其自然繁殖力極低、生長緩慢，不能滿足日益增長的市場需求。因此，研究和開發(fā)鐵皮石斛具有重要的意義。

利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖試管苗是解決鐵皮石斛種苗的有效途徑，而鐵皮石斛的組織培養(yǎng)中有幾個關(guān)鍵的時期:原球莖的誘導、原球莖的繼代增殖、壯苗的培育。根據(jù)這幾個重要的時期及其組織培養(yǎng)的外界條件，我國研究人員在鐵皮石斛組培快繁技術(shù)方面的研究取得了一定的進展。本文就近年來鐵皮石斛組培快繁技術(shù)的研究現(xiàn)狀進行了綜述，包括外植體的選擇，不同基本培養(yǎng)基、激素、添加物對其增殖與分化的影響，以及生根壯苗的方法等，以期為實現(xiàn)鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考與理論依據(jù)。

1 外植體的選擇

目前，誘導鐵皮石斛原球莖采用的外植體主要有種子［4－6］、無菌苗幼苗莖段［7－9］、根尖［10］及人工種子［11］等。針對不同外植體，取材方法也不同，通常選取長勢健壯，株高在3cm以上的無菌苗，小心剝?nèi)ト~片、切除根部，將莖段切成0.5～1.0cm的帶節(jié)小段，培養(yǎng)40d后獲得類原球莖［7］。如切取0.3～0.5cm的根尖為外植體，誘導根尖形成了愈傷組織、類原球莖或直接轉(zhuǎn)化成芽且獲得再生植株［10］;采用無菌種子作為外植體時，在離體培養(yǎng)條件下，種子萌發(fā)率可達95%，種子萌發(fā)后形成原球莖，原球莖可以直接發(fā)育形成幼苗，又可以由原球莖產(chǎn)生大量愈傷組織，由愈傷組織再分化發(fā)育成幼苗［4］。溫明霞［12］等研究結(jié)果表明，由種子誘導的愈傷組織分化能力較強，由種胚培養(yǎng)的原球莖的質(zhì)量也較高，但種齡愈長，萌發(fā)時間愈短，萌發(fā)率愈高。

2 基本培養(yǎng)基的選擇

選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)最關(guān)鍵的一步，不同的培養(yǎng)途徑、不同的培養(yǎng)階段和目的，所對應(yīng)的培養(yǎng)基也不同。鐵皮石斛組織培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基包括MS，1/2MS，N6，改良 N6，SH、KS、VW、Kundson C，1/2N6等，但對最適培養(yǎng)基的選擇卻不同，主要在于外植體來源不同所致。如以種胚作為培養(yǎng)材料，曾宋君［13］等研究發(fā)現(xiàn)N6培養(yǎng)基對鐵皮石斛胚的萌發(fā)和生長最好，而以莖尖作為培養(yǎng)材料，N6培養(yǎng)基誘導愈傷組織能力明顯不如MS。曾宋君［5］等將鐵皮石斛種子在SH、改良N6，MS，KS，VW，Kundson C培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得出最適培養(yǎng)基為改良N6或自制PT培養(yǎng)基。張治國［14］等研究了6種不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖增殖的影響，結(jié)果表明，1/2MS是原球莖增殖的適宜培養(yǎng)基。朱艷［15］等以鐵皮石斛莖段誘導叢生芽作為目的，篩選出1/2MS誘導叢生芽的效果好，生成的苗粗壯。鮑騰飛［7］等也認為最有利于鐵皮石斛類原球莖的生長增殖的基本培養(yǎng)基為1/2MS。

3 植物生長調(diào)節(jié)劑對鐵皮石斛原球莖增殖與分化的影響

鐵皮石斛原球莖增殖是鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中一個十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，通過誘導石斛產(chǎn)生原球莖，可為之后的分化、壯苗生根奠定基礎(chǔ)。培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑對植物細胞分裂、誘導器官形成和次生產(chǎn)物的合成都具有重要作用，一般高濃度的細胞分裂素有利于誘導芽的發(fā)生，低濃度的生長素有利于根的形成。一定濃度范圍的生長素和細胞分裂素組合能促進原球莖的形成和芽的分化［16］。陳兆貴［17］等認為最佳培養(yǎng)基配比為MS+NAA1.0mg/L+6－BA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L，接種35d鐵皮石斛原球莖增殖倍數(shù)達5倍。羅吉鳳［18］等研究結(jié)果表明，原球莖分化適宜的培養(yǎng)基1/2MS+BA2 mg/L+NAA0.2 mg/L+IBA0.1 mg/L+蔗糖3%。在培養(yǎng)過程中，降低固體基本培養(yǎng)基元素的含量有利于原球莖的生長，但不利于原球莖的分化［19］。侯丕勇［20］等認為NAA，IAA，IBA和GA3有利于原球莖的生長與分化，而偏酸的培養(yǎng)基和滅活的真菌不利于原球莖的生長與分化，滅活真菌容易引起原球莖的形態(tài)變異。在原球莖增殖培養(yǎng)基、叢芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中加入1mg/L AgNO3，可提高原球莖的增殖速度和叢芽的分化效率，明顯促進種苗的生長，提高移栽成活率［21］。蔣林［22］等在1/2MS培養(yǎng)基中加入0－0.5mg/L的NAA，發(fā)現(xiàn)對鐵皮石斛原球莖的增殖、分化和芽苗的生長均有促進作用，芽苗株高與NAA的濃度呈正相關(guān)規(guī)律。這與劉驊［23］等報道的鐵皮石斛原球莖的繼代增殖，以不加任何天然提取物為好的結(jié)論相反。

4 培養(yǎng)基添加物對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響

在培養(yǎng)基中加入一些天然有機物，如椰汁、蘋果汁、土豆汁、馬鈴薯提取液等，能提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等，對鐵皮石斛原球莖的增殖和分化有促進作用［16，20，24－25］，但香蕉汁對原球莖的增殖和分化有抑制作用［14，22，26］。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，對原球莖的增殖生長影響也較大。在原球莖分化中，蔗糖濃度以3%為分化的臨界值，蔗糖2%為原球莖分化的適宜濃度［3］。

5 生根壯苗

壯苗培養(yǎng)是提高移栽成活率的一項重要措施，生根效果也直接影響到生產(chǎn)效益。此階段的關(guān)鍵在于嚴格篩選激素的種類和濃度。劉驊［26］等認為，最適宜鐵皮石斛試管苗壯苗的培養(yǎng)基是B5或1/2MS基本培養(yǎng)基中添加2mg/L的NAA，香蕉提取物10%，蔗糖2%。生根壯苗適宜的培養(yǎng)基還有 N6+10% 香蕉汁［13］，1/2MS+IBA0.1mg/L［27］，1/2MS+10% 香蕉汁 +0.5%AC［15］，改良 N6+0.2mg/LNAA+10%香蕉汁［28］等。從文獻報道可知，在生根培養(yǎng)基中通常加入香蕉汁［13，15，28］、蔗糖［15，27］可促進生根壯苗。

6 展望

盡管我國在鐵皮石斛組培方面取得了突破性進展，但仍存在繁殖系數(shù)偏低，增殖難，繼代所需周期偏長等問題，也尚未建立經(jīng)濟高效低成本的標準化種苗生產(chǎn)體系。因此，仍需加強鐵皮石斛離體培養(yǎng)繁殖技術(shù)的研究，探索通過組培加快育種和提高種苗的繁殖速度，解決目前市場需求。

［1］白美發(fā)，黃敏．鐵皮石斛組培技術(shù)研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(36):15802－15803．

［2］高劍平，張梁，孫莉娜，等．鐵皮石斛組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究概述［J］．福建農(nóng)業(yè)科技，2010(4):78－79．

［3］陸兵．鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進展［J］．黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2009(2):164－167．

［4］葉秀嶙，程式君，王伏雄，等．黑節(jié)草未成熟種子的形態(tài)發(fā)育及其在離體培養(yǎng)時的表現(xiàn)［J］．云南植物研究，1988，10(3):285－290．

［5］曾宋君，程式君，張京麗，等．五種石斛蘭的胚培養(yǎng)及其快速繁殖研究［J］．園藝學報，1998，25(1):75－80．

［6］冉懋雄．石斛［M］．北京:科學技術(shù)文獻出版社，2002．

［7］鮑騰飛，徐步青，王芬，等．鐵皮石斛類原球莖液體懸浮培養(yǎng)增殖體系構(gòu)建［J］．東北林業(yè)大學學報，2010，38(12):49－53．

［8］張紅梅，劉建東，王巖花，等．鐵皮石斛莖段快繁技術(shù)研究［J］．山西農(nóng)業(yè)大學學報 (自然科學版)，2010，30(6):495－499．

［9］郭洪波，于曉丹，陳麗靜，等．鐵皮石斛莖節(jié)離體培養(yǎng)的研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2007，18(11):2659－2660．

［10］詹忠根．鐵皮石斛根尖誘導叢生芽研究［J］．中草藥，2006，37(6):928－931．

［11］魏鳳娟．鐵皮石斛組織培養(yǎng)與栽培技術(shù)研究進展［J］．廣東農(nóng)業(yè)科學，2010，(4):81－85．

［12］溫明霞，聶振明，林媚，等．鐵皮石斛組織培養(yǎng)與快速繁殖研究進展［J］．廣西農(nóng)業(yè)科學，2007，38(3):227－230．

［13］曾宋君，程式君．石斛的試管苗快速繁殖［J］．中藥材，1996，19(10):490－491．

［14］張治國，劉驊，王黎，等．鐵皮石斛原球莖增殖的培養(yǎng)條件研究［J］．中草藥，1992，23(8):431－433．

［15］朱艷，秦民堅．鐵皮石斛莖段誘導叢生芽的研究［J］．中國野生植物資源，2004，22(2):56－57．

［16］吳明綱，康春風，魯潤龍．霍山石斛帶節(jié)間的莖段在IBA/NAA誘導下的組織培養(yǎng)［J］．中國科學技術(shù)大學學報，2001，31(5):624－628．

［17］陳兆貴，譚?。煌に嘏浔葘﹁F皮石斛組織培養(yǎng)的影響研究［J］．惠州學院學報 (自然科學版)，2006，26(3):11－14．

［18］羅吉鳳，程治英，龍春林．鐵皮石斛快速繁殖和離體種質(zhì)保存的研究［J］．廣西植物，2006，26(1):69－73．

［19］李桂鋒，李進進，許繼勇，等．鐵皮石斛研究綜述［J］．中藥材，2010，33(1):150－153．

［20］侯丕勇，郭順星．懸浮培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖在固體培養(yǎng)基上生長和分化的研究［J］．中國中藥雜志，2005，30(10):729－732．

［21］李進進，廖俊杰，許繼勇，等．AgNO3在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中抗衰老作用 ［J］．中草藥，2007，38(6):914－917．

［22］蔣林，丁平，鄭迎冬．添加劑對鐵皮石斛組織培養(yǎng)和快速繁殖的影響［J］．中藥材，2003，26(8):539－541．

［23］劉驊，張治國．鐵皮石斛試管苗壯苗培養(yǎng)基的研究［J］．中國中藥雜志，1998，23(11):654－656．

［24］唐桂香，黃福燈，周偉軍．鐵皮石斛的種胚萌發(fā)及其離體繁殖研究［J］．中國中藥雜志，2005，30(20):1583－1585．

［25］張治國，王黎，劉驊，等．鐵皮石斛原球莖分化適宜培養(yǎng)基研究［J］．中國中藥雜志，1993，18(1):16－19．

［26］劉驊，張治國．鐵皮石斛試管苗壯苗培養(yǎng)基的研究［J］．中國中藥雜志，1998，23(11):654－656．

［27］陳薇，寸守銑．鐵皮石斛莖段離體繁殖［J］．植物生理學通訊，2002，38(2):145．

［28］張偉，陳坤．藥用石斛的組織培養(yǎng)及管理研究［J］．南陽師范學院學報(自然科學版)，2004，3(6):41－44．