艾必燕，陳俊穎，鄧玉江，陳建康，楊 揚，米本中，黃文濤，樵星芳 (.重慶市中藥研究院，重慶400065;.解放軍第4醫(yī)院，重慶40000;.第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室，重慶40008)

目前，C57BL6小鼠是常用的實驗用小鼠品系，廣泛應(yīng)用于遺傳工程小鼠的研制，在解析基因功能、制備人類重大疾病模型的研究中具有重要作用。迄今為止，利用C57BL6小鼠建立的遺傳工程小鼠品系達到4 000余種［1］。南京大學(xué)國家遺傳工程小鼠資源庫總共收集了300余種，包括糖尿病、肥胖癥、心血管系統(tǒng)疾病等多種人類重大疾病，絕大部分小鼠品系是利用C57BL6小鼠品系研制的。病理組織學(xué)觀察是小鼠疾病模型診斷與判定的重要指標(biāo)。與數(shù)量繁多的來自C57BL6小鼠的遺傳工程小鼠品系相對應(yīng)的是正常C57BL6小鼠本身的組織與病理學(xué)背景不清楚，這為來自C57BL6小鼠品系的大量的遺傳工程小鼠的應(yīng)用造成了一定的障礙。鑒于此，本實驗選取C57BL/6J小鼠作為實驗對象，利用組織學(xué)技術(shù)，對C57BL/6J小鼠的呼吸系統(tǒng)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征進行觀察，并系統(tǒng)比較其與人類呼吸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征，為小鼠遺傳工程疾病模型研究與應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從南京大學(xué)模式動物研究所購得6周齡C57BL/6J小鼠20只，平均體重為17 g左右，其中雌性10只，雄性10只，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠2只，1雌1雄，自由飲水進食，飼料采用SPF級全價營養(yǎng)鼠飼料。動物飼養(yǎng)籠具(籠內(nèi)空間142平方英寸)、飲水瓶定期消毒，所用墊料經(jīng)高壓滅菌，飼養(yǎng)房內(nèi)定期紫外燈消毒。

1.2 標(biāo)本取材及制備

用頸椎脫臼法處死小鼠。用固定板仰臥位固定。解剖和取材順序是先腹腔后胸腔。用手術(shù)剪沿腹部正中線剪開劍突至肛門之間的腹前壁，再沿最低位肋骨分別向左右兩側(cè)剪開側(cè)腹壁至脊柱兩旁，完全暴露胸腹腔器官。依次取出氣管、支氣管、肺等組織。取出的器官及組織立即分別裝入編好號碼的試管中，用10%中性緩沖福爾馬林固定。

1.3 石蠟切片制作

1.3.1 脫水透明與石蠟包埋 將包好的各組織放入自動脫水機，經(jīng)過不同濃度的梯度酒精溶液脫水，酒精濃度分別為70%、80%、95%和100%。樣本脫水后經(jīng)二甲苯溶液浸泡透明，并放入石蠟中浸透。之后放入融化的液體石蠟中包埋。

1.3.2 切片與貼片 使用石蠟切片機，調(diào)整切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角進行常規(guī)切片。切片完成后，將切片投入到48℃的溫水浴中，切片自然展平后，用涂有5%明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。

1.4 HE染色

常規(guī)進行HE染色。首先梯度酒精溶液和蒸餾水對樣本進行浸水處理，之后分別用蘇木精和伊紅染色液對切片進行染色處理，再用梯度酒精溶液和無水乙醇對樣本進行脫水處理。最后經(jīng)二甲苯溶液透明處理后，中性樹膠封固。

圖1 C57BL6小鼠呼吸系統(tǒng)組織切片(HE染色)

1.5 圖像觀察采集和標(biāo)注

將每一張染好的切片分別在放大倍數(shù)為10×4倍、10×10倍、10×20倍、10×40倍的顯微鏡下觀察，然后在上述各倍數(shù)下用數(shù)碼相機照像采圖，再將圖片在計算機中對器官的組織進行觀察、標(biāo)注。

2 結(jié)果

2.1 氣管

小鼠呼吸系統(tǒng)組織學(xué)特征與人的不同主要在氣管腺，小鼠氣管腺分3種:漿液腺、粘液腺及混合腺，主要分布于粘膜固有層(圖1a、b)。人的氣管腺主要為混合腺，分布于粘膜下層。

2.2 肺

2.2.1 肺部整體結(jié)構(gòu) 肺組織分實質(zhì)和間質(zhì)兩部分。實質(zhì)為肺內(nèi)支氣管的各級分支及其末端的大量肺泡;間質(zhì)是肺內(nèi)的結(jié)締組織、血管、淋巴管和神經(jīng)等(圖1c)。

2.2.2 肺導(dǎo)氣部 終末細支氣管，其上皮由兩種細胞組成，即纖毛細胞和無纖毛的克拉拉細胞(圖1d、e、f)。

2.2.3 肺呼吸部 呼吸性細支氣管是終末細支氣管的分支(圖1g、h)，為導(dǎo)氣部過度到呼吸部的管道，其管壁不完整，出現(xiàn)少量肺泡開口，故有換氣功能。肺泡管見于相鄰肺泡開口之間的部分管壁上有許多開口，自身管壁的結(jié)構(gòu)很少。在切片上呈現(xiàn)一系列相鄰肺泡開口之間的結(jié)節(jié)狀膨大(圖1i、j)。肺泡為半球形的小囊，開口于肺泡囊。肺泡管或呼吸性細支氣管，是肺進行氣體交換的主要部位，構(gòu)成肺的主要結(jié)構(gòu)。肺泡上皮有兩種細胞:Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞。Ⅰ型細胞:又稱扁平細胞，由于肺泡隔很薄，肺泡上皮與毛細血管內(nèi)皮緊密相貼，兩者的細胞核不易分辨，因此Ⅰ型細胞無法辨認。Ⅱ型細胞:又叫分泌細胞，細胞核大，呈圓形，細胞頂部胞質(zhì)呈泡沫狀(圖1k)。在肺泡腔或肺泡隔內(nèi)，還可以見到塵細胞，為含塵埃顆粒的巨噬細胞(圖1l)。

3 討論

由于C57BL6是制備遺傳工程動物模型的常用小鼠品系，已成功應(yīng)用于多種人類重大疾病模型的創(chuàng)制［2-6］。因此，為了方便比較正常小鼠的各個器官的組織形態(tài)，我們選用C57BL/6J小鼠(該小鼠是1921年C.C.Little對Miss Abby Lathrop品系交配繁育而成，于1948年由Jackson實驗室從Hall引入的6號系)作為實驗對象。選取C57BL/6J小鼠的主要器官，利用組織切片技術(shù)，通過取材、10%中性緩沖福爾馬林固定、脫水、包埋、常規(guī)HE染色，制作了1 589張切片。采用顯微鏡觀察、攝影、圖像采集和計算機圖像標(biāo)注，建立了相對系統(tǒng)的小鼠組織學(xué)圖譜。

由于要觀察正常健康小鼠的組織形態(tài)，我們選取的小鼠都在生長旺盛期。因此，所取材料的細胞都處于最佳生長狀態(tài)。本文對小鼠的呼吸系統(tǒng)進行了詳細的觀察與標(biāo)注，形成了較為系統(tǒng)的小鼠呼吸系統(tǒng)組織學(xué)圖譜。本實驗發(fā)現(xiàn)，C57BL6小鼠的呼吸系統(tǒng)與人體呼吸系統(tǒng)的主要差異在于氣管腺。小鼠氣管腺分3種:漿液腺、粘液腺及混合腺，主要分布于粘膜固有層。人的氣管腺主要為混合腺，分布于粘膜下層。因此，在利用C57BL6小鼠制備呼吸系統(tǒng)疾病動物模型時，人與小鼠之間氣管腺的差異應(yīng)作為重要的診斷參考指標(biāo)。本實驗還為小鼠應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病動物模型的研制提供了較為系統(tǒng)的正常小鼠呼吸系統(tǒng)組織學(xué)圖譜。目前，該圖譜作為數(shù)據(jù)庫的一部分已于國際互聯(lián)網(wǎng)在線發(fā)布，為呼吸系統(tǒng)疾病小鼠模型的建立、診斷及應(yīng)用提供了有價值的參考。

［1］The Jackson Laboratory.JAX Mice and Services［DB/OL］.http://jaxmice.jax.org/index.html.

［2］顏 偉，胡厚源，周 林，等.兩種LXR激動劑對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化影響的對照研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，27 (5):381－3841.

［3］Plump AS，Smith JD，Hayek T，et al.Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficientmice created by homologous recombination in ES cells［J］.Cell，1992，71(2):343－353.

［4］Meilhac O，Ramachandran S，Chiang K，et al.Role of arterial wall antioxidant defense in beneficial effects of exercise on atherosclerosis in mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21(10):1681－1688.

［5］Napoli C，Williams Ignarro S，De Nigris F，et al.Long-term combined beneficial effects of physical training andmetabolic treatmenton atherosclerosis in hypercholesterolemic mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(23):8797－8802.

［6］Ramachandran S，Penumetcha M，Merchant NK，et al.Exercise reduces preexisting atherosclerotic lesions in LDL receptor knock outmice［J］.Atherosclerosis，2005，178(1):33－38.