解金洪，姜衛(wèi)東，高 想，蔣鳳榮，張鋒莉

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是多種心血管疾病的終末階段，其發(fā)病率和病死率較高。近幾年，我科在中醫(yī)理論指導(dǎo)下組方的利心沖劑，經(jīng)臨床對慢性心力衰竭的治療觀察，其能減輕癥狀，提高療效，改善患者生活質(zhì)量［1］。但其作用機制尚不十分明確。本實驗觀察利心沖劑對心力衰竭模型血流動力學(xué)、凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl－2的影響，探討其對抗心衰的分子作用機制。

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 利心沖劑主要由黃芪、黃精、補骨脂、葶藶子等組成，江蘇南通市中醫(yī)院提供；阿霉素，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：0505031），卡托普利，中美上海施貴寶制藥公司生產(chǎn)（批號：0308E2）?？贵w由美國B＆R提供，引物由上海生物工程公司提供，SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程公司提供。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1．2 動物分組及造模 取50只Wistar大鼠，健康SPF級雄性10周齡Wistar大鼠108只，體重300g±20g，購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證號：SYXK（滬）2007－2008。適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機取10只（雌、雄各半）作為正常組，腹腔注射等體積生理鹽水，給藥容積同阿霉素（ADR）。余40只大鼠用ADR造模，用藥量4mg／kg，每5d注射一次，共3次。末次ADR給藥24h后，隨機選取模型鼠2只，斷頭處死，取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察確認造模成功后，再將所余大鼠隨機分為心衰模型對照組?？ㄍ衅绽委熃M6．3mg／（kg·d），利心沖劑低劑量治療組20g／（kg·d）、利心沖劑高劑量治療組40 g／（kg·d）。各組均精飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1．3 給藥方法 卡托普利治療組、利心沖劑低劑量組、利心沖劑高劑量組造模后次日開始灌胃給藥，連續(xù)給藥21d。正常組及模型組均灌胃等體積的生理鹽水。

1．4 觀察項目及檢測方法

1．4．1 血流動力學(xué)測定 實驗結(jié)束后，禁食12h，稱重，麻醉后手術(shù)游離右側(cè)頸總動脈，經(jīng)右側(cè)頸總動脈插入心室插管（充滿1%肝素），用成都儀器廠RM6280C多道生理信號采集處理系統(tǒng)描記記錄血壓曲線；再繼續(xù)插入，通過左側(cè)動脈瓣和房室瓣進入左心室，描記記錄左心室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓（LVEDVP）、左心室內(nèi)壓最大上升速度（＋dp／dt max）及最大下降速度（－dp／dt max）等數(shù)據(jù)，觀察血流動力學(xué)變化。

1．4．2 病理學(xué)檢查 給藥結(jié)束后，放血處死大鼠，取部分左室心肌，以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，病理切片，HE染色，光鏡觀察。

1．4．3 Real－time PCR 定量檢測凋亡 相關(guān)基因 Bcl－2、Bax的mRNA表達 取新鮮心室組織，總RNA的提取，采用Promega公司試劑盒提取總RNA，紫外線掃描定量。PT－PCR以O(shè)ligo（DT）為引物，加入總RNA 1μg，72℃10min后，依次加入無RNase水，10× RT buffer，25mmol／LMgCl2，250 μmol／L dNTPs，RNasin和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為20μL，42℃保溫15min生成cDNA，在8聯(lián)管中加入Green7．5μL，引物（Bcl－2、casepase3、sod1、sod2、pgc－1a）0．6μL，cDNA2．5μL，無 RNase水4．4μL在real time PCR儀上擴增。比較Ct法（△△Ct法）分析結(jié)果。實驗所用引物（見表1）。

表1 實驗所用引物

2 結(jié) 果

2．1 心肌細胞病理學(xué)變化 正常對照組心肌細胞形態(tài)正常，胞漿紋理清晰；模型組部分心肌細胞水腫，脂肪變性，部分心肌細胞肌壞死、間質(zhì)出血；利心沖劑高劑量組心肌細胞排列緊密，胞漿紋理清晰，無明顯變性，心肌細胞腫脹／斷裂。

2．2 大鼠心衰各組血流動力學(xué)測定 ADR作用后血流動力學(xué)指標LVSP、＋dp／dt max降低和LVEDP、－dp／dt max升高（P＜0．05），顯示心功能受損；治療后心臟血流動力學(xué)指標得到改善，以陽性藥物組與利心沖劑高劑量組最為明顯（P＜0．05）。表明利心沖劑能改善心衰大鼠的血流動力學(xué)，改善大鼠心功能。詳見表2、表3。

2．3 大 鼠 心 衰 各 組 凋 亡 相 關(guān) 基 因 Bcl－2、Bax／Bcl－2 的 改 變（見圖1） 阿霉素作用后 Bcl－2明顯降低（P＜0．01）；Bax／Bcl－2比值＞1，促進細胞凋亡；利心沖劑治療后Bcl－2明顯升高，以高劑量最為明顯（P＜0．01），Bax／Bcl－2比值＜1，抑制心肌細胞凋亡。

表3 各實驗組血流速度變化（±s） m／s

表3 各實驗組血流速度變化（±s） m／s

組別 n ＋dp／dt max －dp／dt max正常組6 5 926．27±43．95 4 566．33±48．09模型組 6 4 071．00±48．831） 3 191．67±24．661）卡托普利組 6 5 138．33±57．392） 3 943．00±114．052）利心低劑量組 6 4 528．00±76．61 3 516．33±55．11利心高劑量組 6 5 036．17±72．862）3） 4 051．83±120．512）3）與空白組比較，1）P＜0．05；與模型組比較，2）P＜0．05；與卡托普利組比較，3）P＜0．05。

表2 各實驗組左心室壓力變化（±s） mmHg

表2 各實驗組左心室壓力變化（±s） mmHg

組別 n LVSP LVEDP正常組6 169．33±6．65 4．73±0．35模型組 6 109．50±5．091） 19．42±1．411）卡托普利組 6 163．17±9．992） 9．17±0．752）利心低劑量組 6 148．33±6．02 18．10±0．46利心高劑量組 6 153．67±6．562） 12．00±0．922）3）與空白組比較，1）P＜0．05；與模型組比較，2）P＜0．01；與卡托普利性對照組比較，3）P＜0．05

圖1 各組凋亡相關(guān)基因 Bcl－2、Bax／Bcl－2mRNA 變化量

3 討 論

從心衰臨床表現(xiàn)看，屬中醫(yī)“心悸”、“喘證”、“水腫”等病證范疇。多數(shù)研究者認為本病屬本虛標實之證，本虛為心氣虛、心陽虛，標實為血瘀、水阻、痰飲。在臨床工作中以益氣補腎利水為法則，組建利心沖劑治療心衰，取得了滿意的臨床療效，臨床心功能得到明顯好轉(zhuǎn)，血清檢測BNP等指標明顯改善。

ADR屬蔥環(huán)類化合物，ADR復(fù)制心衰模型已經(jīng)得到公認［2］，ADR作用后表現(xiàn)為LVSP、＋dp／dt max降低和LVEDP、－dp／dt max升高（P＜0．05），顯示心功能受損；治療后心臟的血流動力學(xué)指標得到改善，以陽性藥物組與利心沖劑高劑量組最為明顯（P＜0．05）。表明利心沖劑能改善心衰大鼠的血流動力學(xué)，改善大鼠心功能，進一步驗證了利心沖劑治療慢性心力衰竭的臨床療效。

近年研究發(fā)現(xiàn)，凋亡所致心肌細胞的死亡與病理性的心室重構(gòu)密切相關(guān)。凋亡是心肌細胞死亡的形式之一，在CHF的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［2］。Bcl－2家族是細胞凋亡最重要的調(diào)控因子之一，在細胞凋亡通路中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［3］。Bax與Bcl－2是一對常用的促凋亡和抗凋亡基因，Bax／Bcl－2比值大于1時，促進心肌細胞凋亡；比值小于1時，抑制心肌細胞凋亡［4］。本實驗?zāi)Ｐ徒M病理形態(tài)學(xué)顯示，心肌細胞呈一定量的凋亡，凋亡相關(guān)基因 Bcl－2明顯降低，Bax／Bcl－2比值增高，提示ADR能通過激活凋亡家族基因誘導(dǎo)凋亡。經(jīng)利心沖劑治療后，以上病理及病理生理學(xué)的改變均得到一定的改善，利心沖劑減少心肌細胞凋亡，改善心肌重構(gòu)，改善血流動力學(xué)，降低Bax／Bcl－2比值，抑制凋心肌細胞凋亡，對心衰心肌細胞起保護作用。

本實驗結(jié)果顯示，利心沖劑能改善心衰大鼠的血流動力學(xué)，改善大鼠心功能，通過增加Bcl－2的表達，Bax／Bcl－2比值降低，抑制了心肌細胞凋亡，使心力衰竭得以改善，這種抑制心肌細胞凋亡的作用可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)的。

［1］高想，倪衛(wèi)兵，陶志強，等．中西醫(yī)結(jié)合治療慢性心力衰竭60例臨床觀察［J］．江蘇中醫(yī)藥，2007，39（6）：32－33．

［2］Schulze PC，Spate U．Insulin－like grouth factor－1and muscle wasting in chronic heart failure［J］．Int J Biochem Cell Biol，2005，37（10）：2023－2035．

［3］古曉娜，劉占旗，戰(zhàn)景明．MAPKs在Bcl－2家族調(diào)控細胞凋亡中的作用［J］．國外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊，2008，35（2）：65．

［4］Oltvai ZN，Milliman CL．Korsmeyer SJ．Bcl－2helerodimerizes in vi

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